瑤醫九龍十八癥湯對胃潰瘍熱證大鼠胃黏膜損傷及相關因子的影響*

包富龍 鄧晶晶 閆國躍，2 王文博 曾詩睿 李 梅 李 彤，2△

（1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001；2.廣西壯瑤醫藥與醫養結合人才小高地，廣西 南寧 530001）

九龍十八癥湯是廣西民間治療胃潰瘍、急慢性胃炎、胃痛的經驗方，由九龍盤、十八癥、田皂角、山菠蘿、白狗腸、一點紅、香附、陳皮、厚樸、野蕎麥、佛手組成。本方臨床運用效果較為理想，收錄于《瑤醫臨床驗方集》［1］。本課題組通過構建大鼠胃潰瘍熱證模型，探討九龍十八癥湯治療胃潰瘍熱證的機制，為其臨床應用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量280～320 g，購于長沙市天勤生物技術有限公司［許可證號：SCXK（湘）2019-0014］。飼養溫度（22±2）℃，相對濕度50%～60%，保持室內光照明暗各12 h。適應性喂養7 d后用于實驗。本研究涉及的動物實驗符合實驗動物倫理學要求。

1.2 藥物與試劑 九龍十八癥湯組方藥物購買于南寧市水街藥材市場，經廣西中醫藥研究院中藥資源所黃云峰副研究員鑒定。水提取物稠膏的制備：取組方10劑藥量按1∶10的比例加蒸餾水，浸泡30 min后，武火加熱煮沸后文火微沸1 h，倒出所得湯劑，藥渣同法煎煮2次，合并濾液，水浴濃縮成稠膏狀提取物，生藥質量濃度為3.2 g/g，放于4℃冰箱保存，使用時用蒸餾水配制到相應濃度。干姜水煎劑的制備：干姜500 g加蒸餾水2 000 mL，武火加熱煮沸后微沸煎煮，濃縮至500 mL，即生藥質量濃度為1 g/mL，儲存于4℃冰箱備用。冰醋酸（廣東光華科技股份有限公司，批號：20170812）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批號：141115）；左金丸（湖北香連藥業有限責任公司生產，國藥準字 Z42020884）。6-keto-PGF1α、血栓素 B2（TXB2）、白細胞介素-8（IL-8）ELISA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要儀器 1510酶標儀，Thermo Fisher Scientific Oy美國賽默飛；TDL-5-A低速離心機，上海安亭科學儀器廠；DM18光學顯微鏡，德國徠卡公司；游標卡尺，中國上海三圈牌。

1.4 分組與造模 參考文獻［2-4］，將60只大鼠隨機分為空白組、模型組、左金丸組（陽性藥組）、九龍十八癥湯高劑量組（高劑量組）、九龍十八癥湯中劑量組（中劑量組）、九龍十八癥湯低劑量組（低劑量組），每組10只，雌雄各半。除空白組外，各組大鼠每日用干姜水煎液灌胃2次，每次5 mL/kg體質量，連續14 d，兩次間隔時間4 h。于造模第11天起，每日第1次干姜水灌胃后禁食不禁水，第2次干姜水灌胃后4 h給予15%醋酸1 mL灌胃1次，恢復進食。連續4 d。空白組予等量的蒸餾水灌胃。模型組死亡1只，其余組大鼠全部存活。模型的驗證：造模結束后從各組大鼠中隨機抽1只，禁食不禁水12 h，水合氯醛麻醉后處死摘取整個胃組織，肉眼觀察胃黏膜潰瘍情況，剪胃潰瘍部位制作HE染色切片后進行光學顯微鏡下檢查。大鼠胃潰瘍熱證模型的評定指標如下。1）體征指標［5］：主癥為口渴多飲、舌紅，次癥為消谷善饑、牙齦紅腫、糞便干結、小便量少色黃、亢奮、鼻唇爪趾耳郭發紅。2）胃部解剖學和組織學檢查［6-7］：胃黏膜可見明顯火山口樣潰瘍，胃黏膜彌漫性充血，黏膜表面黏液細胞分泌減少，淋巴細胞浸潤，胃主細胞減少。滿足以上的評定標準，即可認為大鼠胃潰瘍熱證模型復制成功。

1.5 給藥方法［8］造模成功后次日，各組給予相應藥物灌胃，九龍十八癥湯按體表面積法換算成大鼠的等效劑量，10.75 g/kg作為中劑量組，高劑量為21.50 g/kg，低劑量為5.37 g/kg，左金丸組為1 g/kg。空白組、模型組予等量蒸餾水灌胃，給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續7 d。

1.6 標本采集與檢測 1）血清IL-8、6-keto-PGF1α、TXB2檢測。末次給藥后，把各組大鼠轉移至代謝籠，搜集糞便和尿液（24 h代謝量）。水合氯醛麻醉后開腹，主動脈采血約4～5 mL置于不加抗凝劑的試管內，室溫靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液分裝入1.5 mL EP管中，放置到-20℃冰箱中保存，用ELISA法檢測免疫指標。2）黏膜病變和潰瘍指標測定。采血后立即解剖大鼠，充分暴露胃體，肉眼觀察腹腔及胃體病變情況，與周圍組織或臟器粘連及粘連的程度，記錄并拍照。觀察各組大鼠胃壁損傷、胃黏膜充血情況，用游標卡尺測定潰瘍中心，量取最大橫徑（d2）和縱徑（d1），潰瘍指數（S）［9］按以下公式計算：S=π·d1/2·d2/2（注：π取3.14）。潰瘍抑制率=（模型組平均潰瘍指數-給藥組平均潰瘍指數）/模型組平均潰瘍指數×100%。3）胃黏膜病理組織HE染色。切取胃部置于預冷的PBS中漂洗干凈表面血漬，吸干水分后剪取部分胃組織用10%多聚甲醛溶液固定24 h，行石蠟包埋，切片后進行HE染色。

1.7 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。計量數據以（±s）表示，組間兩兩比較用單因素方差分析，方差齊用LSD法檢驗，方差不齊用Tamhane′s T2法檢驗。P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異具有極顯著性。

2 結果

2.1 各組大鼠胃組織肉眼觀察情況 空白組：胃組織結構完整，黏膜呈淡紅色，表面光滑，并覆蓋有較多黏液，皺襞表面光滑，走向有規則，黏膜表面完整，無潰瘍、水腫及充血等病理變化。模型組：胃竇、胃大彎黏膜糜爛可見多處出血灶，可見數量不等的圓形或橢圓形火山口樣潰瘍，呈中間凹陷，周圍隆起狀，且潰瘍底部平坦覆蓋有淺白色苔膜，邊界清晰，周圍黏膜水腫充血，無穿孔。陽性藥物組潰瘍灶易分辨，可見少量炎性滲出物，顏色較周圍正常組織白，個別黏膜有輕微糜爛，出血灶肉眼觀察明顯比模型組小、少。九龍十八癥湯高劑量組：胃黏膜可見輕微的糜爛，潰瘍較平坦，局部黏膜缺損范圍小于模型組，有個別愈合較好。九龍十八癥湯中劑量組：潰瘍愈合較好，大部分可以找到潰瘍灶，面積較小，部分可見少量充血點及炎性滲出物，浸潤深度最小，個別已愈合。九龍十八癥湯低劑量組：胃黏膜有不同程度糜爛，潰瘍灶明顯，多數胃體仍可見出血灶，恢復情況是給藥組中最差的。

2.2 各組大鼠胃組織HE染色觀察 見圖1，圖2。空白組：黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層結構完整，形態規則。上皮細胞呈單層柱狀細胞核小、圓形，未見核分裂。肌層細胞致密完好，漿膜層完整，未見炎細胞浸潤和出血。模型組：可見潰瘍處黏膜缺損，腺體消失，黏膜面表層見炎性滲出，其下可見壞死組織血管增生擴張充血形成肉芽組織，期間大量炎性細胞浸潤，漿膜層較多炎性細胞滲出。陽性藥組：胃黏膜恢復較完整，黏膜腺體重現，壞死組織已基本消失，間質充血、水腫基本消失，炎性細胞及滲岀物比模型組明顯減少。九龍十八癥湯高劑量組：多數胃黏膜結構恢復較好，壞死組織較少，較多炎性細胞浸潤，黏膜面較多炎性及纖維素滲出。中劑量組：胃黏膜恢復好，壞死組織消失，個別已基本恢復，間質僅可見少量炎性細胞，血管輕度充血。低劑量組：胃黏膜有一定程度的修復，但在給藥組中恢復程度最差，仍可見不少壞死組織和滲出物，可見炎細胞浸潤。

圖1 各組大鼠胃病理組織（HE染色，50倍）

圖2 各組大鼠胃病理組織（HE染色，100倍）

2.3 各組大鼠潰瘍指數及潰瘍抑制率比較 見表1。模型組與空白組比較潰瘍指數有顯著差異（P＜0.05）。各給藥組潰瘍指數與模型組比均有顯著差異（P＜0.05）。中劑量組抑制率最高，且和陽性藥組比有顯著差異（P＜0.05）。高劑量組抑制率高于陽性藥組但沒有顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠潰瘍指數及潰瘍抑制率比較（±s）

表1 各組大鼠潰瘍指數及潰瘍抑制率比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與陽性藥組比較，▲P＜0.05。下同。

組別空白組模型組陽性藥組高劑量組中劑量組低劑量組n 9 8 9 9 9 9潰瘍指數（mm2）0 8.84±0.78*5.06±0.79*#4.67±0.94*#3.21±0.69*#▲5.83±0.71*#潰瘍抑制率（%）--42.79 47.19 63.66 33.99

2.4 各組大鼠血清IL-8、6-keto-PGF1α和TXB2水平比較 見表2。各組大鼠血清IL-8水平從高到低為模型組、低劑量組、陽性藥組、高劑量組、中劑量組、空白組，與空白組比較，中劑量組IL-8沒有顯著差異，其余組均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，用藥組均顯著降低（P＜0.01）；與陽性藥組比較，高、低劑量組沒有顯著差異（P＞0.05），中劑量組有顯著差異（P＜0.05）。各組大鼠血清6-keto-PGF1α水平從高到低為空白組、中劑量組、高劑量組、陽性藥組、低劑量組、模型組；與空白組比較，其余組含量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，除了低劑量組，其余組均顯著高于模型組（P＜0.01或P＜0.05）；與陽性藥組比較，高劑量組、低劑量組沒有顯著差異（P＞0.05），中劑量組有顯著差異（P＜0.01）。各組大鼠血清TXB2水平從高到低為模型組、低劑量組、陽性藥組、高劑量組、中劑量組、空白組；與空白組比較，其余組TXB2含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組降低程度沒有顯著差異（P＞0.05），其余組均有顯著性差異（P＜0.01）；與陽性藥組比較，高劑量組沒有顯著差異（P＞0.05），中、低劑量組有顯著差異（P＜0.01）。6-keto-PGF1α/TXB2的比值由高到低為空白組、中劑量組、高劑量組、陽性藥組、低劑量組、模型組。

表2 各組大鼠血清IL-8、6-keto-PGF1α、TXB2水平及6-keto-PGF1α/TXB2比值比較（±s）

表2 各組大鼠血清IL-8、6-keto-PGF1α、TXB2水平及6-keto-PGF1α/TXB2比值比較（±s）

組別空白組模型組陽性藥組高劑量組中劑量組低劑量組n 9 8 9 9 9 9 IL-8（pg/mL）289.79±17.42 387.24±24.48**333.65±18.00**##326.49±24.46**##304.94±35.79##▲347.18±17.36**##6-keto-PGF1α（pg/mL）360.62±13.64 245.31±9.97**267.58±20.17**#277.37±12.91**##295.94±25.65**##▲▲256.71±10.93**TXB2（pg/mL）208.40±12.66 344.94±21.76**269.54±11.28**##265.20±12.89**##233.73±17.12**##▲▲330.86±26.45**▲▲6-keto-PGF1α/TXB2 1.73 0.71 0.99 1.05 1.27 0.78

3 討論

胃潰瘍臨床主要表現為中上腹周期性、節律性鈍痛、腹脹、反酸、燒灼感［10］。胃潰瘍病因有環境、飲食、免疫、感染和遺傳等，通常是多種因素聯合作用的結果［11］。胃潰瘍的瑤醫病名稱作革施捫，屬于瑤醫的扭類病（即胃病癥），捫證（即痛證）。瑤醫認為本病是因為氣候失常，人體感受寒邪、疫瘴邪氣、痧氣，外邪侵入人體經脈，壅阻于胃部，日久邪氣盈盛，阻滯經脈，人體盈虧失衡，三元失諧，形成邪盈過盛的病理狀態，經脈不通則痛；或饑飽失常、飲酒過量，導致胃脾功能受損，形成脾胃正虧過衰、邪盈過盛，人體盈虧失衡，三元失諧，日久成癆，不榮則痛［12］。治療以祛邪為急，針對氣滯、寒凝、濕熱、血瘀等致病因素，祛除其主要“病邪”，以打藥祛邪；正虧過衰以扶正為先，以風藥扶正。胃潰瘍熱證屬于瑤醫里的邪盈過盛而正虧不衰癥。九龍十八癥湯在組方中以九龍盤、十八癥、白狗腸、野蕎麥為主藥，都屬于瑤藥中的風打相兼藥。九龍盤祛風除濕，理氣止痛，止血散瘀；十八癥祛風、散瘀止痛；白狗腸涼血、行瘀；野蕎麥清熱解毒、活血散瘀、消腫止痛。方中主藥功效以清熱解毒、活血散瘀為主，能清泄胃熱，化胃絡熱久所生瘀血。以田皂角、厚樸、山菠蘿、一點紅、香附、佛手、陳皮為配藥。田皂角清熱解毒、止血、拔毒生肌；厚樸理氣行滯、祛風鎮痛；山菠蘿清熱解毒、行氣止痛、止血生肌。此3味藥屬于瑤藥中的風打相兼藥。一點紅清熱解毒、止痛、活血散瘀；香附理氣止痛、止血；陳皮理氣化積；佛手理氣，和胃止痛。此4味藥屬于瑤藥中的風藥。方中配藥功效以理氣止痛、止血生肌為主，還能輔助主藥加強清熱解毒、活血散瘀的功效。全方共奏清熱解毒，理氣止痛之功效，祛除中焦胃之熱毒，使機體恢復三元和諧，盈虧平衡的狀態。

胃潰瘍的發病機制復雜，現有研究發現前列腺素能影響胃黏膜血流量且對胃腸黏膜的細胞起保護作用［13］。其中PGI2既可使胃黏液分泌增加，防止H+回滲，又能增加胃黏膜血流量，改善胃黏膜微循環灌注，起到保護胃黏膜的作用；而TXA2能使胃黏膜動脈強烈收縮、血小板聚集形成血栓，同時介導細胞及溶酶體膜的破壞，引發急性炎癥應答，使中性粒細胞向炎癥部位聚集，從而使胃黏膜缺血缺氧，細胞變性壞死，使H+外溢，造成出血和潰瘍。健康人PGI2/TXA2保持一定的比例［14-15］。在胃潰瘍炎癥反應的傳遞過程中IL-8等促炎細胞因子發揮著至關重要的作用［16-17］。PGI2、TXA2生物半衰期極短，離體后很快轉化為穩定的代謝物6-keto-PGF1α和TXB2，因此一般通過檢測6-keto-PGF1α和TXB2來反映血清PGI2和TXA2的含量。

本研究發現九龍十八癥湯能改善大鼠胃組織潰瘍的情況，減輕胃竇、胃大彎黏膜糜爛的程度，修復出血灶，顯著改善胃黏膜水腫充血的情況。各給藥組潰瘍面積和深度比模型組顯著減小，潰瘍指數與模型組比均有顯著差異。光鏡下觀察各組胃組織的病理切片，九龍十八癥湯各劑量組大鼠胃黏膜有不同程度的修復，黏膜腺體重現。黏膜面表層壞死組織減少，改善間質充血、水腫的情況，炎癥細胞減少，浸潤現象減輕。

各造模組大鼠血清IL-8水平均有所上升，除了中劑量組均顯著高于空白組，說明本實驗胃潰瘍模型的形成和IL-8含量升高有關。在給藥干預后，各給藥組血清中IL-8含量均有所下降，九龍十八癥湯各劑量組和模型組比均有顯著差異，中、高劑量組均優于陽性藥組，且中劑量組和陽性藥組比有顯著差異。各造模組大鼠血清6-keto-PGF1α水平均顯著低于空白組，說明本實驗胃潰瘍模型的形成和PGI2含量降低有關。在給藥干預后，各給藥組血清6-keto-PGF1α含量均有所升高。九龍十八癥湯高、中劑量組和模型組比有顯著差異，中、高劑量組均優于陽性藥組，且中劑量組和陽性藥組比有顯著差異。各造模組大鼠血清TXB2水平均顯著高于空白組，說明本實驗胃潰瘍模型的形成和TXB2含量升高有關。在給藥干預后，各給藥組血清中TXB2含量均有所降低，九龍十八癥湯高、中劑量組和模型組比有顯著差異，中、高劑量組均低于陽性藥組，且中劑量組和陽性藥組比有顯著差異。由各組大鼠血清6-keto-PGF1α/TXB2比值可知，各給藥組的比值均有上升，中劑量組上升最快。實驗結果提示，九龍十八癥湯能降低大鼠血清中IL-8、TXB2的水平，升高6-keto-PGF1α水平，使6-keto-PGF1α/TXB2的比值水平趨于平衡，從而起到促進潰瘍愈合，減少潰瘍形成的作用。以上情況綜合說明九龍十八癥湯對大鼠胃潰瘍（熱證）模型具有較好的治療效果，初步確定九龍十八癥湯治療胃潰瘍熱證的有效性。