人參皂苷Rh2對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷中NLRP3、IL-1β、TNF-α表達(dá)及SOD活性的影響研究*

范致星 張 偉 唐艷紅 王 晞 李亞會(huì) 黃從新

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢大學(xué)心血管病研究所，心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430060）

據(jù)《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2019》數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)目前罹患冠心病（CHD）的人數(shù)高達(dá)1 100萬(wàn)人，死亡率已持續(xù)增長(zhǎng)到115/10萬(wàn)，是嚴(yán)重危害國(guó)民健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。早期血運(yùn)重建是CHD首選治療策略，然而同時(shí)引起的心肌缺血再灌注損傷（IRI）是導(dǎo)致心室功能障礙和影響遠(yuǎn)期預(yù)后的主要因素［2-3］。最近有研究顯示，超氧化物歧化酶（SOD）在心肌IRI時(shí)合成減少，而外源性補(bǔ)充SOD可有效減輕氧自由基損傷［4］。NLRP3炎癥小體作為一種重要的模式識(shí)別受體，其介導(dǎo)炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的分泌同樣參與了心肌IRI的發(fā)生發(fā)展［5］。隨著中醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)關(guān)于中醫(yī)藥手段治療缺血性心肌病的研究已得到廣泛的關(guān)注，應(yīng)用前景十分廣闊［6］。人參皂苷Rh2作為人參中最主要的藥理活性成分之一，在抗過(guò)敏、調(diào)節(jié)免疫功能及改善心肌缺血等方面有一定藥理活性［7］。但是目前針對(duì)人參皂苷Rh2防治心肌IRI的研究甚少。因此，本研究擬探究人參皂苷Rh2對(duì)大鼠心肌IRI中NLRP3、IL-1β、TNF-α表達(dá)及SOD活性的影響。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，SPF級(jí)，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：42010200000231，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（鄂）2017-0012。大鼠自由飲水進(jìn)食。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（25±2）℃，濕度（45±15）%，12 h明暗周期。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審議同意并批準(zhǔn)。

1.2 試藥與儀器

1）藥物：人參皂苷Rh2購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司（20 mg：每瓶，貨號(hào)：A0241），取200 mg人參皂苷Rh2溶解于40 mL DMSO中，制成5 mg/mL的藥液，灌胃所用藥液需以此比例當(dāng)日配制并使用。肝素購(gòu)自中國(guó)江蘇萬(wàn)邦生化制藥有限公司（2 mL∶12 500單位，國(guó)藥準(zhǔn)字H32020612）。IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海西塘生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：F15810）。2）試劑：兔抗大鼠NLRP3（貨號(hào)：bs-24563R）及TNF-α多克隆抗體（貨號(hào)：bs-10802R）購(gòu)自中國(guó)北京博奧森生物技術(shù)有限公司。山羊抗兔免疫熒光試劑盒（貨號(hào)：YT102）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。TTC試劑購(gòu)于浙江省華東醫(yī)藥股份公司（貨號(hào)：B0721）。SOD試劑盒購(gòu)于南京建成生物科技有限公司（貨號(hào)：A001-1）。二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于美國(guó)MPBIO公司（貨號(hào)：MP 0219605591）。3）儀器：電子分析天平（MP200A，上海良品儀器廠），光學(xué)顯微鏡（DSX500，奧林巴斯公司），石蠟包埋機(jī)（EG1150，徠卡公司），石蠟切片機(jī)（ULTRACUT-R，徠卡公司），多功能DMR顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)（DM 4000，徠卡公司），低溫高速離心機(jī)（Hitachi CF-5型，日立）。

1.3 分組與給藥

將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、人參皂苷Rh2低劑量組、人參皂苷Rh2高劑量組，每組10只。人參皂苷Rh2低劑量組予人參皂苷10 mg/kg，人參皂苷Rh2高劑量組予人參皂苷20 mg/kg，每日1次灌胃給藥，每次根據(jù)大鼠當(dāng)日體質(zhì)量計(jì)算灌胃液體積，對(duì)照組及模型組大鼠給予等量DMSO，持續(xù)灌胃10 d。

1.4 模型制備

腹腔麻醉（戊巴比妥鈉30 mg/kg）大鼠并固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，呼吸機(jī)輔助通氣（吸呼比為1∶2），于大鼠胸骨左緣第3～4肋開(kāi)胸，再充分暴露心臟后，用套有直徑約0.5 cm乳膠管的4-0絲線穿過(guò)大鼠前降支（LAD）起始部，拉緊絲線結(jié)扎，阻斷LAD 0.5 h后，剪斷絲線，接著行4 h再灌注。整個(gè)造模過(guò)程中用小動(dòng)物心電圖機(jī)觀察大鼠心電圖變化，心電圖有ST-T抬高（拉緊絲線）及ST-T降低（剪斷絲線）變化過(guò)程，提示建模成功［8］。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 測(cè)定大鼠心肌梗死面積 心肌IRI模型建立成功后，分離大鼠右側(cè)頸外動(dòng)脈，快速注射1.5 mL伊文斯藍(lán)，隨后在麻醉狀態(tài)下處死大鼠并完整摘取心臟，用生理鹽水反復(fù)沖洗并除去血管、心房、脂肪及其他無(wú)關(guān)組織，主要保留左心室，濾紙吸干左心室表面水分后-20℃冰箱冷凍。0.5 h后自心尖部向上將左心室均勻切成5片并行TTC染色，梗死區(qū)最終顯示白色，根據(jù)白色梗死區(qū)面積評(píng)估大鼠心肌梗死情況。

1.5.2 測(cè)定大鼠SOD活性 心肌IRI模型建立成功后，在大鼠麻醉狀態(tài)下打開(kāi)大鼠腹腔并分離出腹主動(dòng)脈，用采血針從腹主動(dòng)脈采集血液標(biāo)本，采集的血液2 500 r/min離心15 min獲得血清，于-20℃冰箱保存待檢。后續(xù)按照SOD試劑盒說(shuō)明書，采用比色法在440 nm、660 nm條件下測(cè)定吸光度（A）值，分析計(jì)算SOD活性。

1.5.3 ELISA法測(cè)定IL-1β 在組織勻漿器（加PBS勻漿10%）中勻漿心肌組織塊，在4℃下以3 000 r/min的速度離心15 min，將澄清的上清液保存在-20℃下進(jìn)行檢查。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)上清液中IL-1β的含量。

1.5.4 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)大鼠心肌組織中NLRP3蛋白含量 心肌IRI模型建立成功后，在大鼠麻醉狀態(tài)下處死大鼠，完整摘取大鼠心臟后，收集各組左心室心肌，將獲得的心肌組織進(jìn)行勻漿并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組取50 μg總蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，上到膠板的上樣孔進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后切下目的蛋白條帶膠塊，按照黑色板→海綿→濾紙→膠塊→PVDF膜→濾紙→海綿→白色板次序夾緊后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜，NLRP3一抗孵育PVDF膜過(guò)夜，第二天，沖洗PVDF膜3次后二抗孵育，按照顯影定影試劑盒相關(guān)說(shuō)明書配制顯影液和定影液進(jìn)行顯色曝光，分析計(jì)算NLRP3蛋白水平，GAPDH作為內(nèi)參。

1.5.5 免疫熒光檢測(cè)TNF-α的表達(dá) 收集各組左心室心肌標(biāo)本，使用梯度酒精對(duì)組織進(jìn)行脫水處理，然后將組織包埋在石蠟塊中。包埋好的蠟塊使用病理切片機(jī)進(jìn)行切片并依次在不同濃度二甲苯，無(wú)水乙醇及酒精里進(jìn)行脫蠟。微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)，血清封閉后加TNF-α一抗，加完一抗后于4℃濕盒中孵育過(guò)夜，第2天沖洗切片3次后加熒光二抗，濕盒中37℃孵育1 h后滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。使用顯微鏡圖像采集系統(tǒng)從每個(gè)切片中隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，并通過(guò)Image J 1.52v專業(yè)圖像分析軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。TNF-α的表達(dá)與平均熒光強(qiáng)度成正比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積比較

見(jiàn)表1。與模型組比較，人參皂苷Rh2低劑量組、人參皂苷Rh2高劑量組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較（%，±s）

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較（%，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組人參皂苷Rh2低劑量組人參皂苷Rh2高劑量組n5555心肌梗死面積-42.08±3.97 36.39±3.42△31.22±2.86△

2.2 各組大鼠NLRP3、IL-1β表達(dá)及SOD活性的比較

見(jiàn)表2，見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，模型組、人參皂苷Rh2低劑量組、人參皂苷Rh2高劑量組大鼠心肌組織NLRP3、IL-1β的表達(dá)及血清SOD活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rh2低劑量組、人參皂苷Rh2高劑量組大鼠心肌組織NLRP3、IL-1β的表達(dá)及血清SOD活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠NLRP3、IL-1β表達(dá)及SOD活性比較（±s）

表2 各組大鼠NLRP3、IL-1β表達(dá)及SOD活性比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別對(duì)照組模型組人參皂苷Rh2低劑量組人參皂苷Rh2高劑量組NLRP3蛋白0.132±0.012 0.527±0.020*0.383±0.017*△0.298±0.014*△IL-1β（pg/mL）113.10±15.14 428.72±33.35*373.38±41.24*△302.71±29.49*△SOD活性（U/mL）96.63±16.63 52.16±10.25*71.25±13.49*△84.68±14.40*△

圖1 NLRP3蛋白質(zhì)免疫印跡條帶圖

2.3 各組大鼠心肌組織TNF-α表達(dá)的比較

見(jiàn)表3，圖2。熒光顯微鏡下觀察TNF-α的表達(dá)情況，TNF-α蛋白顯紅色熒光，與對(duì)照組相比，TNF-α在模型組中表達(dá)明顯升高；與模型組比較，人參皂苷Rh2低劑量組與人參皂苷Rh2高劑量組中TNF-α的表達(dá)明顯降低，其中人參皂苷Rh2高劑量組降低更顯著（P＜0.05）。

表3 各組大鼠心肌組織TNF-α表達(dá)的比較（平均熒光強(qiáng)度，±s）

表3 各組大鼠心肌組織TNF-α表達(dá)的比較（平均熒光強(qiáng)度，±s）

組別對(duì)照組模型組人參皂苷Rh2低劑量組人參皂苷Rh2高劑量組n 5555 TNF-α 30.22±5.42 196.58±9.66*124.74±6.42*△90.39±4.18*△

圖2 各組心肌組織中TNF-α的表達(dá)情況（免疫熒光染色，200倍）

3 討論

及時(shí)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（CABG）以及藥物溶栓抗血小板抗凝等是治療CHD最有效的方案［9］。然而，許多實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐都表明，缺血后的血流再灌注會(huì)加重心肌損傷，導(dǎo)致心肌功能、代謝、結(jié)構(gòu)以及電生理狀態(tài)進(jìn)一步的損害，出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞和微血管功能障礙、心肌壞死、心律失常、心肌頓抑等一系列病理生理改變，嚴(yán)重影響其治療效果，心肌IRI的防治已成為目前的研究熱點(diǎn)［10］。越來(lái)越多的研究證實(shí)，中西醫(yī)結(jié)合的治療方案可能是實(shí)現(xiàn)心肌IRI防治的最佳方法［11］。傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理論認(rèn)為，血瘀通常貫穿著CHD的始終。多項(xiàng)藥理研究表明，人參皂苷在改善缺血性損傷、抗炎及耐缺氧、促進(jìn)造血與凝血、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面顯示出良好的藥理活性，是一種很有開(kāi)發(fā)潛質(zhì)的藥物［12］。

大量實(shí)驗(yàn)研究表明，某些炎性細(xì)胞因子，如IL-1β、TNF-α等介導(dǎo)的炎癥在心肌IRI的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用［13］。作為模式識(shí)別受體，天然免疫分子家族NLRPs可識(shí)別病原相關(guān)分子模式和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式，并通過(guò)活化免疫系統(tǒng)促進(jìn)炎癥因子釋放［14］。NALPs蛋白家族共有14個(gè)成員，分別命名為NLRP1-14。其中NLRP3炎癥小體能被許多外界刺激（如缺血）直接誘導(dǎo)產(chǎn)生，然后將Pro-caspase1活化為caspase1，后者又可結(jié)合IL-1β前體，導(dǎo)致IL-1β及TNF-α合成分泌增加，參與免疫反應(yīng)［13］。課題組前期研究也已證實(shí)NLRP3介導(dǎo)IL-1β、TNF-α的分泌與心肌IRI密切相關(guān)［15］。SOD已證實(shí)可作為一種內(nèi)源性氧自由基清除劑，具有清除氧自由基的能力［16］。丁華勝等多項(xiàng)研究提示，在心肌IRI中增強(qiáng)SOD的表達(dá)及活性，可對(duì)缺血再灌注心肌起到明顯的保護(hù)作用［17-18］。

人參皂苷Rh2是日本學(xué)者Nakata率先從紅參中分離出的單體［19］。由于人參皂苷Rh2藥理作用廣泛，其在缺血性心肌疾病中的作用亦受到了重視。邵懇等發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2可改善高脂大鼠氧化應(yīng)激與炎癥水平，增加大鼠心肌缺血再灌注后外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的數(shù)量，從而保護(hù)受損心肌［20］。曲萌等發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2可通過(guò)降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平而對(duì)糖尿病大鼠心肌發(fā)揮保護(hù)作用［21］。在本研究中，通過(guò)建立大鼠心肌IRI模型，觀察了人參皂苷Rh2預(yù)處理對(duì)大鼠缺血再灌注心肌NLRP3、IL-1β、TNF-α的表達(dá)及血清SOD活性的影響。結(jié)果表明，人參皂苷Rh2可以逆轉(zhuǎn)缺血再灌注心肌細(xì)胞中NLRP3、IL-1β及TNF-α蛋白的高表達(dá)，增強(qiáng)SOD活性，從而減小心肌梗死面積。這表明人參皂苷Rh2減輕心肌IRI的機(jī)制可能與降低心肌NLRP3蛋白的高表達(dá)，減少炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的分泌水平并增強(qiáng)SOD活性相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)初步探討了人參皂苷Rh2對(duì)缺血再灌注心肌的保護(hù)作用，為心肌IRI的中藥治療和人參皂苷Rh2在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。