馬源芽孢桿菌的分離與初步鑒定

周珍輝，向雙云

試驗研究

馬源芽孢桿菌的分離與初步鑒定

周珍輝，向雙云

（北京農業職業學院畜牧獸醫系，北京 102442）

為了從健康成年馬腸道分離芽孢桿菌，為獸用益生菌制劑的研究提供豐富的菌株來源。試驗采用從健康成年馬糞便，使用營養肉湯培養基增菌培養后，入90 ℃ 水浴鍋中恒溫水浴20 min，將高溫處理后的肉湯培養物在營養瓊脂培養基上進行劃線分離，挑起單個菌落經3～5次多次劃線分離后，獲得純菌株5株。對分離菌株的培養特性、形態特征、生化特性及運動性進行觀察，結果表明分離菌均符合芽孢桿菌的特征，說明分離菌均為芽孢桿菌。

成年馬；芽孢桿菌；糞便；分離；鑒定

動物腸道中益生菌的種類繁多，芽孢桿菌是其中的一大類，能產生蛋白酶、纖維素酶等多種消化酶及產生維生素、氨基酸多種營養物質，促進動物的生長發育及免疫力的形成。益生芽孢桿菌能夠產生芽孢，因芽孢對外界不良環境具有強大的抵抗力，能抵抗胃酸進入腸道定植，故益生芽孢桿菌在養殖業中應用廣泛[1-4]。馬的腸道十分發達，盲腸是馬屬動物的主要發酵室，含有大量的微生物，在消化中占有重要地位[5]。國內文獻對豬源[6-9]、禽源[10]、山羊源[11]、牛源[12-13]腸道芽孢桿菌均有大量研究報道，但對馬源腸道芽孢桿菌的研究鮮見報道[5]。本研究旨在從健康馬糞便中分離益生芽孢桿菌，為動物微生態制劑的開發提供菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用糞便 試驗用糞便來自北京農業職業學院畜牧場的5匹健康成年馬。5匹健康成年馬依次為汗血寶馬（學名阿哈爾捷金馬），毛色為棕黑色，原產于土庫曼斯坦，其糞樣命名為F1（賽馬）。安達盧西亞馬，毛色為白色，原產地西班牙，其糞樣命名為F2（白馬）；德保矮馬1、德保矮馬2、德保矮馬3，原產地中國廣西德保縣，其糞樣分別命名為F3（矮馬1）、F4（矮馬2）、F5（矮馬3）。

1.1.2 對照用菌種 馬大腸桿菌來自微生物實驗室。

1.1.3 主要試劑 從青島高科園海博生物技術有限公司購買營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、半固體培養基、生化鑒定所用全部試劑等。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 （1）樣品采集與處理：清晨自牧場采集F1（賽馬）、F2（白馬）、F3（矮馬1）、F4（矮馬2）、F5（矮馬3）的新鮮糞便，4 ℃ 保存備用。（2）增菌培養：無菌操作從上述5匹馬新鮮糞便的中心取糞樣適量，放入營養肉湯培養基中，用接種環打散混勻，做好標記，置37 ℃ 恒溫培養4～5 d。（3）分離芽孢菌：將營養肉湯培養物放入90 ℃ 水浴鍋中恒溫水浴20 min，將水浴后的培養物分別接種于營養肉湯培養基、營養瓊脂平板培養基、麥康凱瓊脂平板培養基37 ℃ 恒溫培養24 h后，在營養瓊脂平板培養基反復劃線分離至獲得純菌株。

1.2.2 細菌鑒定 （1）菌落及菌體形態學觀察：從健康成年馬糞便，使用營養肉湯培養基增菌培養后，入90 ℃ 水浴鍋中恒溫水浴20 min，將高溫處理后的肉湯培養物在營養瓊脂培養基上進行劃線分離，挑起單個菌落經3～5次多次劃線分離后，獲得純菌株5株。仔細觀察并記錄5株菌的菌落形態。將5株純菌株分別制片革蘭氏染色后，用顯微鏡油鏡觀察細菌的形態特點。（2）生化試驗：將分離的5株純菌株進行糖發酵試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗，37 ℃ 培養1～3 d，觀察結果。同時用大腸桿菌為對照株進行上述生化試驗。（3）麥康凱瓊脂平板生長試驗：將分離純化的菌株和對照株大腸桿菌在麥康凱瓊脂平板上進行劃線分離，37 ℃ 培養1～3 d，觀察結果。（4）運動性檢查：將分離純化的菌株和對照株大腸桿菌在半固體培養基穿刺接種，37 ℃ 培養1～3 d，觀察結果。

2 結果與分析

2.1 細菌分離結果

分離菌株在營養肉湯培養基中生長表現為肉湯均勻混濁，管底有黏性沉淀，振搖后能均勻分散。分離菌株在營養瓊脂培養基形成扁平、粗糙、干燥的灰白色菌落。分離菌在麥康凱瓊脂平板培養基上均不生長。

2.2 細菌鑒定結果

2.2.1 菌落形態 分離菌株在營養肉湯培養基中生長表現為肉湯均勻混濁。管底有黏性沉淀，振搖后測能均勻分散。F1（賽馬）、F2（白馬）、F3（矮馬1）、F4（矮馬2）、F5（矮馬3）液面形成菌膜。F1（賽馬）、F2（白馬）、F3（矮馬1）、F4（矮馬2）菌株在營養瓊脂平板培養基形成菌落特征相似，為圓形、扁平、較粗糙、干燥、表面無皺縮的灰白色菌落。F5（矮馬3）菌株在營養瓊脂平板培養基形成扁平、粗糙、干燥、表面明顯皺縮的灰白色菌落。分離菌株在營養瓊脂平板培養基上生長的菌落特點（圖1），符合芽孢桿菌的特征。

2.2.2 革蘭氏染色鏡檢 菌體形態可見：從F1（賽馬）、F2（白馬）、F3（矮馬1）、F4（矮馬2）、F5（矮馬3）分離到的細菌均為Ｇ＋桿菌，為長桿狀，菌體粗，菌體間形成短鏈狀，產生芽孢，芽孢為橢圓形，位于菌體的中央，不大于菌體。符合芽孢桿菌的特征。

2.2.3 細菌生化試驗 5株分離菌的生化試驗結果見表1。

圖1 分離菌株在營養瓊脂培養基上生長的菌落特點

表1 乳酸菌生化試驗結果

注：+表示陽性，-表示陰性。糖發酵試驗中，+表示只產酸，⊕表示產酸產氣，-表示不發酵。

由表1可見，分離菌能分解葡萄糖、乳糖、蔗糖（F1不分解）、麥芽糖（F4不分解）、甘露醇和果糖，不產酸，不產生吲哚，淀粉水解試驗陽性，明膠液化試驗均為陰性。對照菌大腸桿菌能分解葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇和果糖，并產酸產氣，產生吲哚，甲基紅試驗陽性，淀粉水解試驗和明膠液化試驗均為陰性。分離菌的生化試驗基本符合芽孢桿菌的特征。

2.2.4 麥康凱瓊脂平板生長試驗結果 將分離純化的菌株在麥康凱瓊脂平板進行劃線分離，37 ℃ 培養1～3 d，均無細菌生長。而對照的大腸桿菌在麥康凱瓊脂平板上生長良好，菌落呈粉紅色。

圖2 半固體培養基穿刺培養

左為分離菌；右為大腸桿菌

2.2.5 運動性檢查結果 在半固體培養基穿刺培養過程中，分離菌株（見圖2中左邊試管）穿刺線清晰，四周未見云霧狀擴散生長，說明均不產生鞭毛，無運動性，符合芽孢菌的特點。而對照的大腸桿菌（見圖2中右邊試管）有鞭毛能運動，在培養基中沿四周呈云霧狀擴散生長。

3 討論與結論

根據細菌分離、革蘭氏染色鏡檢、培養特性、生化試驗、運動性檢查結果可知，分離得到的5 株腸道菌均符合芽孢桿菌的特征，故F1（賽馬）、F2（白馬）、F3（矮馬1）、F4（矮馬2）、F5（矮馬3）初步鑒定為芽孢桿菌。在后續的工作中將用16SrDNA序列分析法對所分離的細菌進行鑒定，以確定其分類學地位。

試驗過程中，分離的芽孢桿菌在營養瓊脂斜面上保存3個月后仍然存活，但大腸桿菌已經失去活性。說明分離的芽孢桿菌生命力強，易于在營養瓊脂斜面上長期保存。為了獲得純菌株或有雜菌污染時，可用芽孢桿菌的營養肉湯培養物放入90 ℃ 水浴鍋中恒溫水浴20 min殺滅雜菌后再進行培養即可。

在細菌分離過程中，分離的芽孢桿菌在營養肉湯培養基、營養瓊脂平板培養基等基礎培養基上生長良好，說明芽孢桿菌對營養要求不高，易于培養。分離芽孢桿菌在麥康凱瓊脂平板上不生長、半固體培養基上沒有運動性，可以和有鞭毛的大腸桿菌相區別。

在生化試驗過程中，大腸桿菌的糖發酵試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗均呈陽性，淀粉水解試驗和明膠液化試驗均呈陰性，芽孢桿菌在糖發酵試驗中只產酸不產氣，在吲哚試驗、甲基紅試驗淀粉水解試驗中均呈陰性，故以大腸桿菌作為對照菌進行，有利于試驗的觀察。

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（2021–06–01）

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