凝膠色譜法（GPC）檢測特殊膳食食品中小分子肽的分子量分布的研究

◎ 黃偉乾，霍玟希，羅 浩，何敏恒，梁志森，覃天福，邱俊杰

（1.國家加工食品質量檢驗中心（廣東），廣東 廣州 511447；2.廣州檢驗檢測認證集團有限公司，廣東 廣州 511447）

肽是介于氨基酸和蛋白質之間的化合物片段，是兩個或兩個以上的氨基酸以肽鍵相連的化合物，在人體內發揮生理功能，起重要生理作用。具有活性的多肽稱為活性肽，又稱生物活性多肽。一般認為，由2～9個氨基酸組成的就叫作寡肽，10～15個以上氨基酸組成的肽被稱為多肽，由2～15個氨基酸組成的就叫作小分子肽，分子量一般在50～5 000 Da。小部分因其結構簡單，分子量小，不飽和度高，所以能夠通過細胞膜滲透進入細胞內，不需要再次消化，也不需要耗費能量，具有100%吸收的特點，可直接體現生物活性。

常見的特殊膳食類產品包括嬰幼兒配方乳粉、嬰幼兒谷物輔助食品、特殊醫學用途配方食品[1]、運動營養食品[2]等，此類食品為滿足特殊的身體或生理狀況和（或）滿足疾病、紊亂等狀態下的特殊膳食需求，專門加工或配方的食品，其中適度或深度水解配方產品可降低特殊人群的蛋白質過敏反應。

目前報道的檢測肽類物質的方法主要有液相色譜法[3-5]、液質聯用法[6]、重量法[7]等。特殊膳食食品中的小分子肽的分子量分布檢測未見報道。凝膠滲透色譜 （Gel Permeation Chromatography，簡稱GPC）又稱為尺寸排阻色譜（Size Exclusion Chromatography，簡稱SEC），它是基于體積排阻的分離機理，通過具有分子篩性質的固定相分離相對分子質量較小的物質，并對分子體積不同、具有相同化學性質的高分子同系物進行分析。本研究采用凝膠色譜分離[8-17]技術，通過優化色譜條件建立了肽分子量[18-20]分布的檢測方法。本方法前處理簡單、快速，可用于特殊膳食食品中肽分子量分布的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

U3000高效液相色譜儀（配PDA檢測器，Thermo公司）；漩渦混合器（MS3 basic，IKA公司）；去離子水發生器（Milli-Q，Millipore公司）；高速離心機（30-K，sigma公司）。

1.2 材料與試劑

細胞色素C（分子量12 500 Da），胰島素（分子量5 807.69 Da），桿菌肽（分子量1 421.7 Da），甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子量451.48 Da），谷胱甘肽（分子量307.32 Da），L-半胱氨酸（分子量121.15 Da），維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素C購自安譜公司；乙腈、三氟乙酸均為色譜純，購于Fisher公司；去離子水（＞18.0 MΩ·cm）由Milli-Q純水系統制備。

1.3 試驗方法

1.3.1 肽標準溶液配制

分別稱取6種肽標準品5 mg（精確到0.01 mg），用流動相溶解定容于5 mL容量瓶中，成1.0 mg·mL-1標準溶液，置于4 ℃下保存1個月。

1.3.2 色譜條件

串聯2支TSK-GEL G2000SWXL（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.06%（v/v）三氟乙酸溶液；等度洗脫：0.0～45.0 min，10% A+90% B；流速0.7 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm；進樣量5 μL。

1.3.3 樣品處理

移取樣品20～50 mg于10 mL容量瓶中，用流動相振蕩溶解，超聲10 min充分提取后定容。在15 000 r·min-1高速離心5 min，取上清液過0.22 μm尼龍濾膜，待HPLC分析。

1.4 肽分子量分布的判斷方法

特殊膳食食品經酶解工藝或添加水解蛋白原料，使樣品中含有較多的小分子肽，將樣品溶解于流動相，經凝膠色譜過濾，依據樣品組分分子體積大小的差別進行分離，肽鍵的特征紫外吸收波長為220 nm，以常見的肽對照品的分子量為識別區間，以界定出樣品中的多肽的分子量分布范圍。

2 結果與討論

2.1 流動相條件的確定

為考察流動相對樣品分離結果的影響，采用5組乙腈-0.06%三氟乙酸溶液流動相體系（25∶75、20∶80、15∶85、10∶90和5∶95）進行實驗，結果顯示，以流動相乙腈-三氟乙酸為10∶90時分離效果好，而且峰形較理想，保留時間適中。

2.2 標準曲線的繪制

通過高效液相色譜確定標準肽的保留時間，見表1，得到系列標準品的色譜圖，以分子量的對數（lgM）對保留時間作圖，經線性回歸得到分子校正曲線方程y=-0.3167x+14.436（R2=0.949 5），見圖1。

圖1 肽標準的分子量對數與保留時間曲線圖

表1 肽標準品的色譜保留時間表

2.3 精密度試驗

選取未進行水解處理的樣品，分別添加6種對照肽標準品，按本方法連續測試6次，6種肽對照品保留時間的相對標準偏差分別為0.20%、0.06%、0.03%，0.06%、0.03%和0.08%，表明具有良好的精密度，能夠滿足測定要求。

2.4 水溶性維生素的干擾評估

小分子肽類物易溶水相溶液中，特殊膳食食品一般添加少量的水溶性維生素（主要有維生素B1、維生素B2、煙酸、維生素B6、維生素C），樣品經本方法前處理稀釋200倍計，以最大含量水平進行評估。實驗結果表明，B族水溶性維生素雖出峰時間較前，但樣品經200倍稀釋后，基本不干擾結果；含量最高維生素C的保留時間＞31 min，其他幾種水溶性維生素的峰高低于半胱氨酸標準峰的3%，并未對分子量分布情況的色譜圖產生明顯的影響。

2.5 對特膳樣品進行檢測

樣品經流動相溶解處理，樣品中小分子肽溶于流動相溶液中，其中以肽對照品的出峰時間作為判斷點，對市售的3種樣品進行分析（嬰兒配方乳粉、特殊醫學用乳蛋白適度水解配方粉、特殊醫學用乳蛋白深度水解配方粉），結果見表2。

表2 樣品中肽分子檢測結果表

響應值越高，區間肽段的占比越高。比較3組的結果發現，嬰兒配方奶粉的水解程度較低，適度水解類產品在5 807.6～370.3 Da分布較均勻，水解程度較嬰兒配方奶粉高。經樣品測試表明，深度水解配方的蛋白質水解程度較適度配方高。由圖2可知，深度水解配方產品的肽分子分布較集中在1 421.7～370.3 Da，說明水解強度較大。

圖2 深度水解樣品的小分子肽分布色譜圖

3 結論

本研究通過GPC凝膠色譜法測定6種肽分子量對照品，建立分子量分布的檢測方法。該方法的6種肽分離效果較好，較準曲線具有較好的穩定性。該方法前處理簡單，可用于特殊膳食中小分子肽分布的檢測，得到有價值的小分子肽信息，為調整產品研發方向提供參考。