凝膠色譜法（GPC）檢測(cè)特殊膳食食品中小分子肽的分子量分布的研究

◎ 黃偉乾，霍玟希，羅 浩，何敏恒，梁志森，覃天福，邱俊杰

（1.國(guó)家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)中心（廣東），廣東 廣州 511447；2.廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司，廣東 廣州 511447）

肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的化合物片段，是兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸以肽鍵相連的化合物，在人體內(nèi)發(fā)揮生理功能，起重要生理作用。具有活性的多肽稱為活性肽，又稱生物活性多肽。一般認(rèn)為，由2～9個(gè)氨基酸組成的就叫作寡肽，10～15個(gè)以上氨基酸組成的肽被稱為多肽，由2～15個(gè)氨基酸組成的就叫作小分子肽，分子量一般在50～5 000 Da。小部分因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分子量小，不飽和度高，所以能夠通過(guò)細(xì)胞膜滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，不需要再次消化，也不需要耗費(fèi)能量，具有100%吸收的特點(diǎn)，可直接體現(xiàn)生物活性。

常見(jiàn)的特殊膳食類產(chǎn)品包括嬰幼兒配方乳粉、嬰幼兒谷物輔助食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品[1]、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品[2]等，此類食品為滿足特殊的身體或生理狀況和（或）滿足疾病、紊亂等狀態(tài)下的特殊膳食需求，專門加工或配方的食品，其中適度或深度水解配方產(chǎn)品可降低特殊人群的蛋白質(zhì)過(guò)敏反應(yīng)。

目前報(bào)道的檢測(cè)肽類物質(zhì)的方法主要有液相色譜法[3-5]、液質(zhì)聯(lián)用法[6]、重量法[7]等。特殊膳食食品中的小分子肽的分子量分布檢測(cè)未見(jiàn)報(bào)道。凝膠滲透色譜 （Gel Permeation Chromatography，簡(jiǎn)稱GPC）又稱為尺寸排阻色譜（Size Exclusion Chromatography，簡(jiǎn)稱SEC），它是基于體積排阻的分離機(jī)理，通過(guò)具有分子篩性質(zhì)的固定相分離相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)，并對(duì)分子體積不同、具有相同化學(xué)性質(zhì)的高分子同系物進(jìn)行分析。本研究采用凝膠色譜分離[8-17]技術(shù)，通過(guò)優(yōu)化色譜條件建立了肽分子量[18-20]分布的檢測(cè)方法。本方法前處理簡(jiǎn)單、快速，可用于特殊膳食食品中肽分子量分布的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

U3000高效液相色譜儀（配PDA檢測(cè)器，Thermo公司）；漩渦混合器（MS3 basic，IKA公司）；去離子水發(fā)生器（Milli-Q，Millipore公司）；高速離心機(jī)（30-K，sigma公司）。

1.2 材料與試劑

細(xì)胞色素C（分子量12 500 Da），胰島素（分子量5 807.69 Da），桿菌肽（分子量1 421.7 Da），甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子量451.48 Da），谷胱甘肽（分子量307.32 Da），L-半胱氨酸（分子量121.15 Da），維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素C購(gòu)自安譜公司；乙腈、三氟乙酸均為色譜純，購(gòu)于Fisher公司；去離子水（＞18.0 MΩ·cm）由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肽標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取6種肽標(biāo)準(zhǔn)品5 mg（精確到0.01 mg），用流動(dòng)相溶解定容于5 mL容量瓶中，成1.0 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃下保存1個(gè)月。

1.3.2 色譜條件

串聯(lián)2支TSK-GEL G2000SWXL（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.06%（v/v）三氟乙酸溶液；等度洗脫：0.0～45.0 min，10% A+90% B；流速0.7 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.3 樣品處理

移取樣品20～50 mg于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相振蕩溶解，超聲10 min充分提取后定容。在15 000 r·min-1高速離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm尼龍濾膜，待HPLC分析。

1.4 肽分子量分布的判斷方法

特殊膳食食品經(jīng)酶解工藝或添加水解蛋白原料，使樣品中含有較多的小分子肽，將樣品溶解于流動(dòng)相，經(jīng)凝膠色譜過(guò)濾，依據(jù)樣品組分分子體積大小的差別進(jìn)行分離，肽鍵的特征紫外吸收波長(zhǎng)為220 nm，以常見(jiàn)的肽對(duì)照品的分子量為識(shí)別區(qū)間，以界定出樣品中的多肽的分子量分布范圍。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相條件的確定

為考察流動(dòng)相對(duì)樣品分離結(jié)果的影響，采用5組乙腈-0.06%三氟乙酸溶液流動(dòng)相體系（25∶75、20∶80、15∶85、10∶90和5∶95）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，以流動(dòng)相乙腈-三氟乙酸為10∶90時(shí)分離效果好，而且峰形較理想，保留時(shí)間適中。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)高效液相色譜確定標(biāo)準(zhǔn)肽的保留時(shí)間，見(jiàn)表1，得到系列標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，以分子量的對(duì)數(shù)（lgM）對(duì)保留時(shí)間作圖，經(jīng)線性回歸得到分子校正曲線方程y=-0.3167x+14.436（R2=0.949 5），見(jiàn)圖1。

圖1 肽標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)與保留時(shí)間曲線圖

表1 肽標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時(shí)間表

2.3 精密度試驗(yàn)

選取未進(jìn)行水解處理的樣品，分別添加6種對(duì)照肽標(biāo)準(zhǔn)品，按本方法連續(xù)測(cè)試6次，6種肽對(duì)照品保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.20%、0.06%、0.03%，0.06%、0.03%和0.08%，表明具有良好的精密度，能夠滿足測(cè)定要求。

2.4 水溶性維生素的干擾評(píng)估

小分子肽類物易溶水相溶液中，特殊膳食食品一般添加少量的水溶性維生素（主要有維生素B1、維生素B2、煙酸、維生素B6、維生素C），樣品經(jīng)本方法前處理稀釋200倍計(jì)，以最大含量水平進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，B族水溶性維生素雖出峰時(shí)間較前，但樣品經(jīng)200倍稀釋后，基本不干擾結(jié)果；含量最高維生素C的保留時(shí)間＞31 min，其他幾種水溶性維生素的峰高低于半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)峰的3%，并未對(duì)分子量分布情況的色譜圖產(chǎn)生明顯的影響。

2.5 對(duì)特膳樣品進(jìn)行檢測(cè)

樣品經(jīng)流動(dòng)相溶解處理，樣品中小分子肽溶于流動(dòng)相溶液中，其中以肽對(duì)照品的出峰時(shí)間作為判斷點(diǎn)，對(duì)市售的3種樣品進(jìn)行分析（嬰兒配方乳粉、特殊醫(yī)學(xué)用乳蛋白適度水解配方粉、特殊醫(yī)學(xué)用乳蛋白深度水解配方粉），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中肽分子檢測(cè)結(jié)果表

響應(yīng)值越高，區(qū)間肽段的占比越高。比較3組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嬰兒配方奶粉的水解程度較低，適度水解類產(chǎn)品在5 807.6～370.3 Da分布較均勻，水解程度較嬰兒配方奶粉高。經(jīng)樣品測(cè)試表明，深度水解配方的蛋白質(zhì)水解程度較適度配方高。由圖2可知，深度水解配方產(chǎn)品的肽分子分布較集中在1 421.7～370.3 Da，說(shuō)明水解強(qiáng)度較大。

圖2 深度水解樣品的小分子肽分布色譜圖

3 結(jié)論

本研究通過(guò)GPC凝膠色譜法測(cè)定6種肽分子量對(duì)照品，建立分子量分布的檢測(cè)方法。該方法的6種肽分離效果較好，較準(zhǔn)曲線具有較好的穩(wěn)定性。該方法前處理簡(jiǎn)單，可用于特殊膳食中小分子肽分布的檢測(cè)，得到有價(jià)值的小分子肽信息，為調(diào)整產(chǎn)品研發(fā)方向提供參考。