兩株水源性銅綠假單胞菌的分離與鑒定

◎ 梁濤波，龍 慧，占忠旭，莫 逆，陳 波，于 帆，吳 鑫

（1.江西省食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330001；2.南昌市疾病預防控制中心，江西 南昌 330038；3.江西潤田實業股份有限公司，江西 南昌 330029）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA），又稱綠膿桿菌，是一種革蘭氏陰性無芽孢棒狀桿菌，屬于假單胞菌屬，細菌的大小約為（0.4～0.9）μm×（1.4～3.0）μm[1-2]。銅綠假單胞菌分布廣泛，在水源、土壤、空氣等自然環境中均能分離[3-5]，而且在人類及一些哺乳動物的呼吸道、腸道、以及皮膚等器官表面也有分布[6-8]。在眾多的臨床病例中發現，銅綠假單胞菌是一種感染風險高、感染部位廣、危害嚴重的條件致病菌，可引起患者嚴重感染，包括敗血癥、肺炎、心內膜炎、中耳炎和角膜炎等[9-11]，并且具有產生多種毒素（溶血毒素）、形成生物膜、耐多種抗生素等生物特性[12-14]。根據國家相關法規和標準，銅綠假單胞菌是自來水和桶裝水中質量安全檢測最常見識別的細菌之一，并且在國家及省級食品藥品監督管理部門的抽檢報道中發現，在2014—2018年有2 350批次的桶裝水樣品中發現了銅綠假單胞菌[15]。隨著人民生活水平的提高，桶裝水進入了全民飲用，其中包括嬰兒和老人，他們的免疫系統不穩定，而且還包括免疫力低下的病人[16-17]。因此，瓶裝水必須符合國家法規和標準規定的衛生要求，從而確保其質量和飲用安全。

本研究根據抽檢任務，對桶裝水樣本按照《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）中銅綠假單胞菌檢測方法進行分離鑒定，獲取了兩株產綠膿菌素的銅綠假單胞菌，針對兩株水源性銅綠假單胞菌分離株，進行了生化鑒定、藥敏分析、毒力基因檢測以及16s DNA測序同源比對分析。本研究對監控和預防桶裝水銅綠假單胞菌污染提供了參考，為桶裝水生產環節預防和控制桶裝水污染銅綠假單胞菌提供科學依據，對桶裝水微生物安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 培養基

營養瓊脂、CN瓊脂平板、綠膿菌素測定培養基、乙酰胺肉湯培養基，均購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 生化鑒定和藥敏紙片

VITEK革蘭氏陰性細菌鑒定卡，革蘭氏陰性菌藥敏卡片（AST-GN16），購自法國梅里埃公司。

1.3 引物

表1 為本實驗設計的引物序列。

表1 引物序列表

根據美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）報道的銅綠假單胞菌毒力基因和溶血基因核酸序列，使用Primer primer 5軟件設計引物，并通過BLAST驗證引物的特異性。

1.4 方法

1.4.1 細菌的分離培養

根據GB 8538—2016中規定的銅綠假單胞菌檢驗方法，對桶裝水樣本進行檢測。通過孔徑半徑為0.45 μm濾膜過濾250 mL水，然后將濾膜放置在CN瓊脂上，在36 ℃恒溫培養48 h后，挑取疑似銅綠假單胞菌的菌株劃線接種在營養瓊脂表面進行培養。將獲取的單菌落分別接種在CN瓊脂上、乙酰胺肉湯培養基、綠膿菌素測定培養基，在36 ℃培養1～5 d后，對細菌的生長特點進行觀察記錄。

1.4.2 細菌染色鏡檢

取分離鑒定純培養獲得的銅綠假單胞菌培養液，挑取一環置于潔凈的玻璃片上并進行涂片，然后通過酒精燈干燥，滴入結晶紫進行初染并使用蒸餾水沖洗，再滴入一滴碘液媒染并使用蒸餾水沖洗，接著加入95%酒精進行脫色，再滴入一滴番紅復染并使用蒸餾水沖洗，最后通過普通光學顯微鏡鏡檢，觀察銅綠假單胞菌的菌落形態。

1.4.3 細菌的生化鑒定和藥敏試驗

取分離鑒定純培養獲得的銅綠假單胞菌培養液，制備細菌懸液使其濃度在0.5～0.6麥氏單位，使用VITEK 2 Compact全自動細菌生化鑒定系統與革蘭氏陰性細菌鑒定卡、細菌藥敏分析系統與革蘭氏陰性菌藥敏卡片（AST-GN16）進行測定分析。

1.4.4 細菌基因組DNA的提取

取分離鑒定純培養獲得的銅綠假單胞菌培養液1 mL，加入1.5 mL離心管中，在12 000 r·min-1離心3 min，去除上清液，然后加入1 mL超純水重懸，在12 000 r·min-1離心3 min，去除上清液，重復操作一次，最后重懸在200 μL超純水中[18]。準備100 ℃沸水，將制備好的菌懸液放入其中煮沸15 min，然后放在冰水浴中5 min，最后在12 000 r·min-1離心3 min，取上清液，為細菌基因組DNA，儲存在-20 ℃待用。

1.4.5 毒力基因和溶血基因的檢測

qPCR反 應 體 系15 μL：2×TSINGKE Master qPCR Mix 7.5 μL、DNA template 2 μL、primer 1.5 μL、ddH2O 4 μL；qPCR反應程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，40個循環，72 ℃采集熒光信號，最后72 ℃充分延伸5 min。

1.4.6 16s rRNA測序

將分離純化的銅綠假單胞菌液，送往上海生工生物工程有限公司（Sangon Biotech）進行16s rRNA測序，并將測序結果利用NCBI BLAST進行核酸序列比對，并使用Mega X軟件進行同源性分析。

2 結果與分析

2.1 菌落培養特性及形狀觀察

CN瓊脂平板劃線培養結果顯示，PA-0659、PA-0661兩株細菌生長態勢良好、菌落飽滿、并且菌落呈現淺綠色，通過紫外照射發現有熒光顯示，結果見圖1。根據綠膿菌素測定培養基細菌培養的結果，加入三氯甲烷和鹽酸，發現上層鹽酸溶液中出現粉色，說明兩株銅綠假單胞菌分離菌均能產生綠膿菌素，結果見圖2。在乙酰胺肉湯中36 ℃培養24 h后，加入1～2滴納氏試劑，發現顏色從深黃色變為磚紅色，說明分離的兩株銅綠假單胞菌分離菌均能產氨，結果見圖3。通過對純培養的兩株銅綠假單胞菌分離菌進行革蘭氏染色以及普通光學顯微鏡鏡檢可以發現，兩株細菌形態為長棒狀、大小約為（0.5～0.8） μm×（1.5～1.8） μm，革蘭氏染色結果顯示為革蘭氏陰性，結果見圖4。

圖1 CN瓊脂平板劃線培養形態圖

圖2 綠膿菌素測定結果圖

圖3 產氨實驗圖

圖4 革蘭氏染色鏡檢圖（油鏡100×）

2.2 生化分析結果

根據VITEK 2 Compact全自動生化分析結果，發現兩株分離菌PA-0659和PA-0661均能分解D-葡萄糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-海藻糖、檸檬酸鹽（鈉）、丙二酸鹽、乳酸鹽和琥珀酸鹽，且COURMARATE酶、γ-谷氨酰轉移酶、β-丙氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶和酪氨酸芳胺酶均為陽性；兩株分離株均不分解蔗糖、側金盞花醇、D-塔格糖、L-阿拉伯醇、D-纖維二糖、5-酮-葡萄糖苷、α-葡萄糖、D-麥芽糖、古老糖和D-山梨醇，且N-乙酰-β-半乳糖氨酶、α-半乳糖苷酶、磷酸酶、氨基乙酸芳胺酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶和谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶均為陰性。生化分析結果表明兩株分離株PA-0659和PA-0661均為銅綠假單胞菌，而且兩株分離株在生化分析中存在一些差異，PA-0659脂酶陽性，PA-0661谷氨酰芳胺酶和尿素酶陽性，詳細結果見表2。

表2 生化鑒定結果表

（續表2）

2.3 耐藥分析結果

兩株分離株PA-0659和PA-0661均能耐受阿莫西林-棒酸、氨芐西林、頭孢匹美、頭孢西丁、頭孢曲松、厄他培南、呋喃妥因和哌拉西林-他唑巴坦等藥物；對氨曲南、超廣譜β-內酰胺酶、復方新諾明等藥物敏感，對阿米卡星、環丙沙星、慶大霉素、亞氨培南、左旋氧氟沙星和妥布霉素等藥物中介，并且PA-0659分離株對藥物頭孢唑啉和替加環素耐受，具體結果見表3。

表3 耐藥分析結果表（單位：μg·mL-1）

2.4 毒力基因和溶血基因檢測結果

經過qPCR擴增目標基因，結果顯示分離株PA-0659含有毒力基因toxA、ExoT、ExoY、ExoU、ExoS以及溶血基因SOB；分離株PA-0661含有毒力基因toxA、ExoT、ExoY以及溶血基因SOB，具體結果見表1。

2.5 同源性分析結果

兩株分離株PA-0659和PA-0661的16s rRNA序列與NCBI報道的銅綠假單胞菌序列進行同源性比對發現，PA-0659和PA-0661與目前報道的銅綠假單胞菌具有高同源性，這進一步說明兩株分離株為銅綠假單胞菌，具體結果見圖5。

圖5 16s rRNA進化樹分析圖

3 結論與討論

本研究依據GB 8538—2016中規定的方法，對兩批桶裝水樣本中的銅綠假單胞菌進行檢測，通過一系列的分離鑒定，獲取了兩株水源性產綠膿菌素銅綠假單胞菌。通過對兩株銅綠假單胞菌分離株的進一步研究發現，PA-0659和PA-0661均能分解D-葡萄糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-海藻糖、檸檬酸鹽（鈉）、丙二酸鹽、乳酸鹽和琥珀酸鹽，COURMARATE酶、γ-谷氨酰轉移酶、β-丙氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶和酪氨酸芳胺酶陽性，而且兩株銅綠假單胞菌的生化存在差異，PA-0659脂酶陽性，PA-0661谷氨酰芳胺酶和尿素酶陽性；耐藥結果表明兩株PA分離株對阿莫西林-棒酸、氨芐西林、頭孢匹美、頭孢西丁、頭孢曲松、厄他培南、呋喃妥因和哌拉西林-他唑巴坦等8種抗生素耐受，而且PA-0659分離株對藥物頭孢唑啉和替加環素耐受。毒力基因和溶血基因檢測結果顯示，PA-0659分離株含有toxA、ExoT、ExoY、ExoU、ExoS毒力基因及溶血基因SOB，PA-0661分離株含有toxA、ExoT、ExoY毒力基因及溶血基因SOB。16s rRNA同源性分析結果顯示，兩株分離株均與目前NCBI報道的銅綠假單胞菌具有較高的同源性，進一步說明兩株分離株為銅綠假單胞菌。

銅綠假單胞菌的Ⅲ型分泌系統[19-21]（Type Ⅲsecretion system，T3SS）是影響宿主被急性感染的重要因素，根據檢測結果分離株PA-0659的T3SS 4種包外毒力蛋白酶（包外酶T、Y、U、S）基因均為陽性，分離株PA-0661包外毒力蛋白酶基因僅有ExoT、ExoY被檢出，初步說明兩株分離株在急性感染宿主能力上有一定的差異。通過分析兩株分離株耐藥情況，可以發現PA-0659相比于PA-0661具有較強的耐藥性，主要區別體現在PA-0659對頭孢唑林和替加環素耐藥。根據NCCLS[22]提供的銅綠假單胞菌ATCC 27853耐藥信息，比較發現本研究分離的兩株PA表現出更強的耐藥，尤其對青霉素類、四代頭孢類和硝基呋喃類等抗生素，這進一步說明兩株分離株有可能在自然環境中發生了變異，使其具備更強耐藥性。

通過比較兩株分離株在生化、耐藥、毒力基因以及16s rRNA同源性，發現兩株分離株均存在一定的差異，說明兩株分離株的來源、生存環境，甚至基因組信息均不同，查詢兩批桶裝水樣品信息發現，兩批水樣品來自不同地區的廠家。

銅綠假單胞菌是一種常見的食源性致病菌，廣泛的分布在自然環境中，是大桶桶裝水主要的微生物污染源。根據最新的2020年中國食品安全抽檢匯總結果，全年共有848批次包裝飲用水中銅綠假單胞菌不合格，其中湖南、廣東和江西檢出最多，分別為139批次、123批次和102批次，可見包裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染情況不容忽視。研究包裝飲用水中銅綠假單胞菌生化特征、耐藥信息、毒力基因以及16s rRNA同源性分析，為桶裝水微生物污染的預防和控制提供科學依據，保障包裝飲用水的安全。