兩株水源性銅綠假單胞菌的分離與鑒定

◎ 梁濤波，龍 慧，占忠旭，莫 逆，陳 波，于 帆，吳 鑫

（1.江西省食品檢驗(yàn)檢測研究院，江西 南昌 330001；2.南昌市疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330038；3.江西潤田實(shí)業(yè)股份有限公司，江西 南昌 330029）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA），又稱綠膿桿菌，是一種革蘭氏陰性無芽孢棒狀桿菌，屬于假單胞菌屬，細(xì)菌的大小約為（0.4～0.9）μm×（1.4～3.0）μm[1-2]。銅綠假單胞菌分布廣泛，在水源、土壤、空氣等自然環(huán)境中均能分離[3-5]，而且在人類及一些哺乳動(dòng)物的呼吸道、腸道、以及皮膚等器官表面也有分布[6-8]。在眾多的臨床病例中發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌是一種感染風(fēng)險(xiǎn)高、感染部位廣、危害嚴(yán)重的條件致病菌，可引起患者嚴(yán)重感染，包括敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎、中耳炎和角膜炎等[9-11]，并且具有產(chǎn)生多種毒素（溶血毒素）、形成生物膜、耐多種抗生素等生物特性[12-14]。根據(jù)國家相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，銅綠假單胞菌是自來水和桶裝水中質(zhì)量安全檢測最常見識別的細(xì)菌之一，并且在國家及省級食品藥品監(jiān)督管理部門的抽檢報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，在2014—2018年有2 350批次的桶裝水樣品中發(fā)現(xiàn)了銅綠假單胞菌[15]。隨著人民生活水平的提高，桶裝水進(jìn)入了全民飲用，其中包括嬰兒和老人，他們的免疫系統(tǒng)不穩(wěn)定，而且還包括免疫力低下的病人[16-17]。因此，瓶裝水必須符合國家法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的衛(wèi)生要求，從而確保其質(zhì)量和飲用安全。

本研究根據(jù)抽檢任務(wù)，對桶裝水樣本按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2016）中銅綠假單胞菌檢測方法進(jìn)行分離鑒定，獲取了兩株產(chǎn)綠膿菌素的銅綠假單胞菌，針對兩株水源性銅綠假單胞菌分離株，進(jìn)行了生化鑒定、藥敏分析、毒力基因檢測以及16s DNA測序同源比對分析。本研究對監(jiān)控和預(yù)防桶裝水銅綠假單胞菌污染提供了參考，為桶裝水生產(chǎn)環(huán)節(jié)預(yù)防和控制桶裝水污染銅綠假單胞菌提供科學(xué)依據(jù)，對桶裝水微生物安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂、CN瓊脂平板、綠膿菌素測定培養(yǎng)基、乙酰胺肉湯培養(yǎng)基，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 生化鑒定和藥敏紙片

VITEK革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡，革蘭氏陰性菌藥敏卡片（AST-GN16），購自法國梅里埃公司。

1.3 引物

表1 為本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物序列。

表1 引物序列表

根據(jù)美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）報(bào)道的銅綠假單胞菌毒力基因和溶血基因核酸序列，使用Primer primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，并通過BLAST驗(yàn)證引物的特異性。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

根據(jù)GB 8538—2016中規(guī)定的銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法，對桶裝水樣本進(jìn)行檢測。通過孔徑半徑為0.45 μm濾膜過濾250 mL水，然后將濾膜放置在CN瓊脂上，在36 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，挑取疑似銅綠假單胞菌的菌株劃線接種在營養(yǎng)瓊脂表面進(jìn)行培養(yǎng)。將獲取的單菌落分別接種在CN瓊脂上、乙酰胺肉湯培養(yǎng)基、綠膿菌素測定培養(yǎng)基，在36 ℃培養(yǎng)1～5 d后，對細(xì)菌的生長特點(diǎn)進(jìn)行觀察記錄。

1.4.2 細(xì)菌染色鏡檢

取分離鑒定純培養(yǎng)獲得的銅綠假單胞菌培養(yǎng)液，挑取一環(huán)置于潔凈的玻璃片上并進(jìn)行涂片，然后通過酒精燈干燥，滴入結(jié)晶紫進(jìn)行初染并使用蒸餾水沖洗，再滴入一滴碘液媒染并使用蒸餾水沖洗，接著加入95%酒精進(jìn)行脫色，再滴入一滴番紅復(fù)染并使用蒸餾水沖洗，最后通過普通光學(xué)顯微鏡鏡檢，觀察銅綠假單胞菌的菌落形態(tài)。

1.4.3 細(xì)菌的生化鑒定和藥敏試驗(yàn)

取分離鑒定純培養(yǎng)獲得的銅綠假單胞菌培養(yǎng)液，制備細(xì)菌懸液使其濃度在0.5～0.6麥?zhǔn)蠁挝唬褂肰ITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)與革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡、細(xì)菌藥敏分析系統(tǒng)與革蘭氏陰性菌藥敏卡片（AST-GN16）進(jìn)行測定分析。

1.4.4 細(xì)菌基因組DNA的提取

取分離鑒定純培養(yǎng)獲得的銅綠假單胞菌培養(yǎng)液1 mL，加入1.5 mL離心管中，在12 000 r·min-1離心3 min，去除上清液，然后加入1 mL超純水重懸，在12 000 r·min-1離心3 min，去除上清液，重復(fù)操作一次，最后重懸在200 μL超純水中[18]。準(zhǔn)備100 ℃沸水，將制備好的菌懸液放入其中煮沸15 min，然后放在冰水浴中5 min，最后在12 000 r·min-1離心3 min，取上清液，為細(xì)菌基因組DNA，儲存在-20 ℃待用。

1.4.5 毒力基因和溶血基因的檢測

qPCR反 應(yīng) 體 系15 μL：2×TSINGKE Master qPCR Mix 7.5 μL、DNA template 2 μL、primer 1.5 μL、ddH2O 4 μL；qPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃采集熒光信號，最后72 ℃充分延伸5 min。

1.4.6 16s rRNA測序

將分離純化的銅綠假單胞菌液，送往上海生工生物工程有限公司（Sangon Biotech）進(jìn)行16s rRNA測序，并將測序結(jié)果利用NCBI BLAST進(jìn)行核酸序列比對，并使用Mega X軟件進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落培養(yǎng)特性及形狀觀察

CN瓊脂平板劃線培養(yǎng)結(jié)果顯示，PA-0659、PA-0661兩株細(xì)菌生長態(tài)勢良好、菌落飽滿、并且菌落呈現(xiàn)淺綠色，通過紫外照射發(fā)現(xiàn)有熒光顯示，結(jié)果見圖1。根據(jù)綠膿菌素測定培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果，加入三氯甲烷和鹽酸，發(fā)現(xiàn)上層鹽酸溶液中出現(xiàn)粉色，說明兩株銅綠假單胞菌分離菌均能產(chǎn)生綠膿菌素，結(jié)果見圖2。在乙酰胺肉湯中36 ℃培養(yǎng)24 h后，加入1～2滴納氏試劑，發(fā)現(xiàn)顏色從深黃色變?yōu)榇u紅色，說明分離的兩株銅綠假單胞菌分離菌均能產(chǎn)氨，結(jié)果見圖3。通過對純培養(yǎng)的兩株銅綠假單胞菌分離菌進(jìn)行革蘭氏染色以及普通光學(xué)顯微鏡鏡檢可以發(fā)現(xiàn)，兩株細(xì)菌形態(tài)為長棒狀、大小約為（0.5～0.8） μm×（1.5～1.8） μm，革蘭氏染色結(jié)果顯示為革蘭氏陰性，結(jié)果見圖4。

圖1 CN瓊脂平板劃線培養(yǎng)形態(tài)圖

圖2 綠膿菌素測定結(jié)果圖

圖3 產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)圖

圖4 革蘭氏染色鏡檢圖（油鏡100×）

2.2 生化分析結(jié)果

根據(jù)VITEK 2 Compact全自動(dòng)生化分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩株分離菌PA-0659和PA-0661均能分解D-葡萄糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-海藻糖、檸檬酸鹽（鈉）、丙二酸鹽、乳酸鹽和琥珀酸鹽，且COURMARATE酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、β-丙氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶和酪氨酸芳胺酶均為陽性；兩株分離株均不分解蔗糖、側(cè)金盞花醇、D-塔格糖、L-阿拉伯醇、D-纖維二糖、5-酮-葡萄糖苷、α-葡萄糖、D-麥芽糖、古老糖和D-山梨醇，且N-乙酰-β-半乳糖氨酶、α-半乳糖苷酶、磷酸酶、氨基乙酸芳胺酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶和谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶均為陰性。生化分析結(jié)果表明兩株分離株P(guān)A-0659和PA-0661均為銅綠假單胞菌，而且兩株分離株在生化分析中存在一些差異，PA-0659脂酶陽性，PA-0661谷氨酰芳胺酶和尿素酶陽性，詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 生化鑒定結(jié)果表

（續(xù)表2）

2.3 耐藥分析結(jié)果

兩株分離株P(guān)A-0659和PA-0661均能耐受阿莫西林-棒酸、氨芐西林、頭孢匹美、頭孢西丁、頭孢曲松、厄他培南、呋喃妥因和哌拉西林-他唑巴坦等藥物；對氨曲南、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、復(fù)方新諾明等藥物敏感，對阿米卡星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、亞氨培南、左旋氧氟沙星和妥布霉素等藥物中介，并且PA-0659分離株對藥物頭孢唑啉和替加環(huán)素耐受，具體結(jié)果見表3。

表3 耐藥分析結(jié)果表（單位：μg·mL-1）

2.4 毒力基因和溶血基因檢測結(jié)果

經(jīng)過qPCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，結(jié)果顯示分離株P(guān)A-0659含有毒力基因toxA、ExoT、ExoY、ExoU、ExoS以及溶血基因SOB；分離株P(guān)A-0661含有毒力基因toxA、ExoT、ExoY以及溶血基因SOB，具體結(jié)果見表1。

2.5 同源性分析結(jié)果

兩株分離株P(guān)A-0659和PA-0661的16s rRNA序列與NCBI報(bào)道的銅綠假單胞菌序列進(jìn)行同源性比對發(fā)現(xiàn)，PA-0659和PA-0661與目前報(bào)道的銅綠假單胞菌具有高同源性，這進(jìn)一步說明兩株分離株為銅綠假單胞菌，具體結(jié)果見圖5。

圖5 16s rRNA進(jìn)化樹分析圖

3 結(jié)論與討論

本研究依據(jù)GB 8538—2016中規(guī)定的方法，對兩批桶裝水樣本中的銅綠假單胞菌進(jìn)行檢測，通過一系列的分離鑒定，獲取了兩株水源性產(chǎn)綠膿菌素銅綠假單胞菌。通過對兩株銅綠假單胞菌分離株的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PA-0659和PA-0661均能分解D-葡萄糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-海藻糖、檸檬酸鹽（鈉）、丙二酸鹽、乳酸鹽和琥珀酸鹽，COURMARATE酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、β-丙氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶和酪氨酸芳胺酶陽性，而且兩株銅綠假單胞菌的生化存在差異，PA-0659脂酶陽性，PA-0661谷氨酰芳胺酶和尿素酶陽性；耐藥結(jié)果表明兩株P(guān)A分離株對阿莫西林-棒酸、氨芐西林、頭孢匹美、頭孢西丁、頭孢曲松、厄他培南、呋喃妥因和哌拉西林-他唑巴坦等8種抗生素耐受，而且PA-0659分離株對藥物頭孢唑啉和替加環(huán)素耐受。毒力基因和溶血基因檢測結(jié)果顯示，PA-0659分離株含有toxA、ExoT、ExoY、ExoU、ExoS毒力基因及溶血基因SOB，PA-0661分離株含有toxA、ExoT、ExoY毒力基因及溶血基因SOB。16s rRNA同源性分析結(jié)果顯示，兩株分離株均與目前NCBI報(bào)道的銅綠假單胞菌具有較高的同源性，進(jìn)一步說明兩株分離株為銅綠假單胞菌。

銅綠假單胞菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)[19-21]（Type Ⅲsecretion system，T3SS）是影響宿主被急性感染的重要因素，根據(jù)檢測結(jié)果分離株P(guān)A-0659的T3SS 4種包外毒力蛋白酶（包外酶T、Y、U、S）基因均為陽性，分離株P(guān)A-0661包外毒力蛋白酶基因僅有ExoT、ExoY被檢出，初步說明兩株分離株在急性感染宿主能力上有一定的差異。通過分析兩株分離株耐藥情況，可以發(fā)現(xiàn)PA-0659相比于PA-0661具有較強(qiáng)的耐藥性，主要區(qū)別體現(xiàn)在PA-0659對頭孢唑林和替加環(huán)素耐藥。根據(jù)NCCLS[22]提供的銅綠假單胞菌ATCC 27853耐藥信息，比較發(fā)現(xiàn)本研究分離的兩株P(guān)A表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥，尤其對青霉素類、四代頭孢類和硝基呋喃類等抗生素，這進(jìn)一步說明兩株分離株有可能在自然環(huán)境中發(fā)生了變異，使其具備更強(qiáng)耐藥性。

通過比較兩株分離株在生化、耐藥、毒力基因以及16s rRNA同源性，發(fā)現(xiàn)兩株分離株均存在一定的差異，說明兩株分離株的來源、生存環(huán)境，甚至基因組信息均不同，查詢兩批桶裝水樣品信息發(fā)現(xiàn)，兩批水樣品來自不同地區(qū)的廠家。

銅綠假單胞菌是一種常見的食源性致病菌，廣泛的分布在自然環(huán)境中，是大桶桶裝水主要的微生物污染源。根據(jù)最新的2020年中國食品安全抽檢匯總結(jié)果，全年共有848批次包裝飲用水中銅綠假單胞菌不合格，其中湖南、廣東和江西檢出最多，分別為139批次、123批次和102批次，可見包裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染情況不容忽視。研究包裝飲用水中銅綠假單胞菌生化特征、耐藥信息、毒力基因以及16s rRNA同源性分析，為桶裝水微生物污染的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)，保障包裝飲用水的安全。