HPLC-MS/MS測(cè)定動(dòng)物源性食品中利巴韋林和金剛烷胺藥物殘留

◎ 虞長(zhǎng)貴

（鄭州中檢科測(cè)試技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450000）

目前，利巴韋林和金剛烷胺均為動(dòng)物源性食品藥物殘留檢測(cè)項(xiàng)目要求，同一種樣品中都要進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是獨(dú)立進(jìn)行檢測(cè)[1-5]。本研究使用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物源性食品中利巴韋林和金剛烷胺藥物殘留，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，節(jié)約資源，為動(dòng)物源性食品中利巴韋林和金剛烷胺藥物殘留檢測(cè)提供一種檢測(cè)技術(shù)手段，在實(shí)驗(yàn)室推廣和應(yīng)用方面具有重要意義[1-5]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（島津公司LCMS 8050）；氮吹濃縮儀（EVA32）；高速離心機(jī)（日立CR21N）；Milli-Q超純水裝置（Milli-Q Integral 5）；PH計(jì)；分析天平（0.000 1 g）；電子天平（0.001 g）；振蕩器（TAITECA）；固相萃取裝置（色譜科）；超聲儀；干燥箱。

1.2 材料與試劑

從市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu)動(dòng)物源性樣品。

甲醇（色譜級(jí)）、乙腈（色譜級(jí)）、甲酸（色譜級(jí)）、乙酸銨（色譜級(jí)）、三氯乙酸、氨水、酸性磷酸酯酶、混合型離子交換固相萃取小柱（CNWBOND PBA）、超純水、利巴韋林、利巴韋林內(nèi)標(biāo)C5、金剛烷胺、金剛烷胺內(nèi)標(biāo)D6及離子型親水性T3色譜柱（ACQUITY UPLC HSS T3 100×2.1 mm，1.8 μm）。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

稱(chēng)取5 g（精確到0.01 g）樣品置于50 mL高速離心管，加入15 mL三氯乙酸溶液和2.5 mL乙腈溶液，渦旋混勻，振蕩10 min，超聲5 min，以20 000 r·min-1高速離心5 min，取上清液至25 mL容量瓶，樣品再加10 mL三氯乙酸溶液，重復(fù)提取，合并提取液至容量瓶，定容至25 mL。

1.3.2 酶解

移取5 mL提取液至50 mL高速離心管，加入1.0 mL乙酸銨溶液，加入100 μL酸性磷酸酯酶，渦旋混勻，37 ℃干燥箱中酶解2 h。取出冷卻至室溫，用氨水調(diào)節(jié)pH至8.5±0.1，渦旋混勻，20 000 r·min-1離心5 min，取上清液備用。

1.3.3 凈化

上清溶液轉(zhuǎn)入經(jīng)活化的PBA固相萃取小柱，依次用5 mL 10%乙腈-乙酸銨緩沖液、2 mL 5%氨水甲醇淋洗，棄去流出液，用真空泵抽干固相萃取柱5 min，再用4 mL甲酸-水-甲醇溶液（2∶8∶90）洗脫至氮吹管，45 ℃水浴下氮吹至近干，加入1.0 mL乙腈-水（9∶1）溶解氮吹管中殘?jiān)＝?jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：離子型親水性色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3 100×2.1 mm，1.8 μm；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：5 mmol·L-1乙酸銨水+0.1%甲酸。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧電離正離子模式；檢測(cè)模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件選擇

常用提取溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等試劑，擬選擇甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯作為提取液。甲醇、丙酮為親水性溶劑，不利于消除基質(zhì)中一些水溶性成分。本方法考察乙腈和乙酸乙酯兩種溶劑對(duì)基質(zhì)進(jìn)行提取，提取效果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，乙腈對(duì)本方法中檢測(cè)兩種物質(zhì)有較高的提取效果。考慮到基質(zhì)中含有蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，因此本方法采用三氯乙酸-乙腈對(duì)基質(zhì)進(jìn)行提取。

表1 空白基質(zhì)測(cè)定結(jié)果表

2.2 酶解試劑選擇

利巴韋林以原藥、利巴韋林單/二/三磷酸酯形式存在，須對(duì)以磷酸酯形式存在的利巴韋林進(jìn)行酶解，才能對(duì)試樣中利巴韋林總量進(jìn)行測(cè)定，采用37 ℃酸性磷酸酯酶對(duì)樣品進(jìn)行酶解，對(duì)比了非酶解、酶解2 h和18 h后利巴韋林總量的測(cè)試結(jié)果。結(jié)果表明，非酶解測(cè)得利巴韋林含量只有酶解2 h含量的2%，酶解2 h和酶解18 h后利巴韋林含量偏差在5%以?xún)?nèi)，因此選擇37 ℃酶解2 h條件。

2.3 固相萃取柱選擇

動(dòng)物源性食品中獸藥殘留采用HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化，考慮固相萃取柱抗干擾、富集目標(biāo)物能力等因素，本方法研究對(duì)比了HLB、C18、PBA 3款固相萃取柱，發(fā)現(xiàn)HLB對(duì)利巴韋林和金剛烷胺富集重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，C18固相萃取柱對(duì)利巴韋林和金剛烷胺富集能力低，平均回收率在20%以下，PBA固相萃取柱對(duì)利巴韋林和金剛烷胺兩種化合物選擇富集能力強(qiáng)，平均回收率能達(dá)到85%以上。因此本方法選用PBA固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

2.4 流動(dòng)相選擇

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜正離子模式對(duì)目標(biāo)物利巴韋林和金剛烷胺進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相中加入甲酸能夠提高利巴韋林和金剛烷胺信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度，加入乙酸銨能夠改變利巴韋林和金剛烷胺峰形，本方法采用5 mmol·L-1乙酸銨水+0.1%甲酸作為流動(dòng)相，梯度洗脫。液相色譜梯度洗脫條件見(jiàn)表2。

表2 液相色譜梯度洗脫條件表

2.5 內(nèi)標(biāo)定量和外標(biāo)定量比較

采用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法兩種方式對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)比對(duì)，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明采用外標(biāo)法回收率偏低，不滿(mǎn)足檢測(cè)要求，本方法采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)。

表3 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法定量結(jié)果比對(duì)表

2.6 質(zhì)譜特征離子選擇

金剛烷胺、利巴韋林及其內(nèi)標(biāo)物在電噴霧電離源模式下采用SCAN全掃描，根據(jù)全掃質(zhì)譜圖中響應(yīng)值高豐度好的離子作為母離子，進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描模式，將其母離子打碎以獲得子離子碎片，選擇響應(yīng)高的碎片離子作為子離子。通過(guò)改變錐孔電壓和碰撞能量?jī)?yōu)化儀器最強(qiáng)響應(yīng)。金剛烷胺、利巴韋林以及其內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜條件見(jiàn)表4。

表4 保留時(shí)間、定性定量離子、錐孔電壓、碰撞能量參數(shù)表

2.7 方法回歸方法、線(xiàn)性范圍及檢出限

取濃度為0.5 μg·kg-1、1 μg·kg-1、2 μg·kg-1、5 μg·kg-1、10 μg·kg-1和20 μg·kg-1金剛烷胺、利巴韋林和濃度為5 μg·kg-1內(nèi)標(biāo)物配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)試，以外標(biāo)物峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積比值作為縱坐標(biāo)（y），外標(biāo)物濃度作為橫坐標(biāo)（x），繪制工作曲線(xiàn)，空白基質(zhì)中添加兩種化合物標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)檢測(cè)，以3倍信噪比為檢出限，以10倍信噪比為定量限，回歸方程，線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見(jiàn)表5。

表5 金剛烷胺、利巴韋林回歸方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限表

在0.5～20 μg·kg-1濃度范圍內(nèi)，外標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值和外標(biāo)物濃度呈良好線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，檢出限為1 μg·kg-1，定量限為2 μg·kg-1，滿(mǎn)足分析要求。

2.8 精密度和加標(biāo)回收

空白樣品加標(biāo)，經(jīng)前處理提取、酶解、凈化后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。利巴韋林、金剛烷胺的回收率為85%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.8%～2.4%，表明該方法具有較好重復(fù)性及準(zhǔn)確性，符合動(dòng)物源性食品中獸藥殘留分析要求。

表6 加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表

3 結(jié)論

本文研究了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中利巴韋林和金剛烷胺的分析方法，通過(guò)提取、酶解、凈化3個(gè)步驟進(jìn)行定量檢測(cè)，方法線(xiàn)性范圍、檢出限、定量限、添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿(mǎn)足分析要求。方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和精確度高，縮減了利巴韋林和金剛烷胺檢測(cè)時(shí)間，提高了效率，可用于動(dòng)物源性食品中利巴韋林和金剛烷胺同時(shí)檢測(cè)，并為其他食品中利巴韋林和金剛烷胺藥物殘留檢測(cè)提供依據(jù)。