通過式高效凈化-高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中噁唑菌酮殘留

◎ 張曉莉，孫 晶，湯苗苗，師敬敬，李芳芳，辛 瑩

（河南廣電計量檢測有限公司，河南 鄭州 450001）

噁唑菌酮是一種新型高效、廣譜的殺菌劑．屬于線粒體呼吸抑制劑，能中止細胞的氧化磷酸化作用，從而使細胞失去能量來源而死亡[1]。噁唑菌酮在農作物種植的病蟲害防治中應用廣泛，同時也容易在土壤、水體、農作物中殘留，造成環境污染并影響食品質量安全。殘留的噁唑菌酮可通過食物鏈在畜禽動物組織中富集，對廣大消費者的健康造成威脅[2]。我國《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2019）中規定，噁唑菌酮在哺乳動物肉類殘留最大限量為0.5 mg·kg-1。

農藥殘留對人體的危害影響較大，因此要加強對食品中農藥殘留的檢測。液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS/MS）定性準確，靈敏度高，已經被廣泛應用于農藥、獸藥殘留領域的定性、定量等確證檢測工作中[3]。目前，僅噁唑菌酮在動物源性產品的檢測方法中未查詢到相關報道。豬肉作為一種日常消費食品，出于安全性考慮，非常有必要建立一種能應用于豬肉中檢測農藥殘留的方法。為滿足實際需要，本研究以豬肉為對象，建立一種采用通過式高效凈化-高效液相色譜-串聯質譜檢測豬肉中噁唑菌酮的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀HPLCMS/MS（Xevo TQD，美國Waters公司）；Vortex-2渦旋混合儀（德國IKA公司）；CT14RDⅡ高速冷凍離心機（上海精科天美公司）；分析天平（德國Sartorius公司）；EFAA-DC24RT氮吹濃縮儀（上海安譜公司）；Milli-Q Advantage A10 純水機（美國Merck Millipore公司）。

1.2 材料與試劑

乙腈、甲醇、乙酸銨（色譜純，美國Fisher公司）；固相萃取柱Oasis? PRIME HLB（6 mL，200 mg，Waters公司）；實驗用水為超純水。噁唑菌酮標準品（100 mg·L-1，BePure公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標液配制

用移液槍準確移取1.0 mL噁唑菌酮標準品（100 mg·L-1），用乙腈定容至10 mL，配成濃度為10 mg·L-1的儲備液。用空白基質溶液配制成1.0～50 μg·L-1的噁唑菌酮標準工作液，現用現配。

1.3.2 色譜條件

BEH-C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流速：0.3 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；流動相A為10 mmol·L-1乙酸銨溶液（含0.1%甲酸），B為乙腈；洗脫程序：0～1 min，60%A；1～3 min，60%～5%A；3～5 min，5%A；5～5.1 min，5%～60%A；5.1～6 min，60%A。質譜條件：電噴霧負離子模式（ESI-），毛細管電壓：2.6 kV；離子源溫度：150 ℃；去溶劑溫度：500 ℃；多反應監測模式（MRM），檢測條件見表1。

表1 噁唑菌酮多重反應監測條件表

1.3.3 樣品前處理

豬肉樣品勻漿，稱取5 g（精確至0.001 g）試樣于50 mL聚乙烯離心管中，加入10 mL 1%甲酸乙腈、5 g氯化鈉，渦旋振蕩15 min，超聲提取15 min，冷凍離心后，轉移上清液，殘留物用10 mL 1%甲酸乙腈重復提取。合并兩次上清液，45 ℃水浴旋轉濃縮至近干，加水定容至2 mL，過PRIME HLB凈化柱，收集全部凈化液。取1 mL凈化，加水定容2 mL，過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS分析。

2 結果與分析

2.1 色譜-質譜條件優化

本研究以C18為色譜柱，比較了乙腈、甲醇為流動相，以及添加不同濃度甲酸和乙酸銨溶液對噁唑菌酮分離及響應的影響。實驗表明，采用梯度洗脫，以乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）為流動相時，噁唑菌酮分離效果較好，靈敏度高。

質譜選用電噴霧離子源，多反應監測模式（MRM）下進行全掃描，考察了在ESI+和ESI-兩種模式下噁唑菌酮各碎片離子的響應值，最終確定定性和定量離子以及相關儀器條件，見表1。

2.2 前處理條件優化

2.2.1 提取條件選擇

乙腈極性大、穿透力強，可減少樣品中脂溶性雜質的溶出，常用于農藥殘留的分析檢測[4]。本實驗比較了乙腈、1%甲酸乙腈和80%乙腈作為提取溶劑的提取效果，通過在空白豬肉樣品中加入一定量的噁唑菌酮標準溶液，使加標濃度為20 μg·kg-1，比較3種不同提取劑的回收率，其提取效果見圖1。其中1%甲酸乙腈回收率最高，達93.5%，因此選用1%甲酸乙腈作為前處理提取劑。

圖1 3種提取溶劑測定豬肉中噁唑菌酮的回收率圖

2.2.2 凈化條件選擇

豬肉中含有大量的脂肪和磷脂，會對目標物檢測造成干擾，為降低實驗成本，本實驗優先選用正己烷進行除脂。樣品經1%甲酸乙腈提取后，加正己烷除酯凈化，實驗結果發現噁唑菌酮回收率低于60%，原因是噁唑菌酮在正己烷中也可以溶解，使樣品在除脂凈化中損失較大，故本實驗考慮其他凈化手段。Oasis? PRIME HLB固相萃取小柱具有獨特的親水-疏水平衡性，其吸附劑為強親水性聚合物，能有效去除脂肪，磷脂等干擾雜質[5]。因此本實驗采用該萃取柱進行凈化。由圖2可以看出，經Oasis? PRIME HLB固相萃取小柱凈化后，脂肪，磷脂等雜質對樣品中噁唑菌酮色譜峰干擾明顯下降，且色譜峰形有很大改善。

圖2 噁唑菌酮經Prime萃取柱凈化前后離子流色譜圖對比圖

2.2.3 基質效應

基質效應（Matrix Effect，ME）是指在色譜分離時，同時洗脫的物質改變了待測組分的離子化效應，而對待測組分信號造成的影響和干擾[6]?？赏ㄟ^基質標準曲線和溶劑標準曲線斜率的比值對目標物的基質效應進行考察。當比值ME＞1時，則為基質增強效應，比值ME＜1時，則為基質抑制效應。本實驗表明，噁唑菌酮在豬肉中ME為0.856 2，即在豬肉中存在基質抑制效應，為減少該效應，提高分析結果準確性，本實驗采用基質標準曲線進行定量分析。

2.2.4 方法學研究

將空白豬肉樣品按1.3.3節進行前處理，添加不同濃度的噁唑菌酮標準品（1.0～50.0 μg·L-1），采用2.1方法測定，以質量濃度為橫坐標，以對應峰面積為縱坐標進行線性擬合，繪制基質標準曲線。結果表明，噁唑菌酮在1.0～50 μg·L-1線性范圍內，相關系數R2為0.995 0，線性關系良好?？瞻棕i肉樣品在0.01 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1、0.05 mg·kg-13個加標濃度下，回收率在82%～89%，相對標準偏差（RSD）在0.3%～1.1%，見表2。根據儀器3倍和10倍信噪比，結合濃度外推法確定方法檢出限和定量限，最終得出噁唑菌酮的檢出限（LOD）為1.0 μg·kg-1，定量限（LOQ）為3.3 μg·kg-1。

表2 噁唑菌酮在豬肉中添加回收結果表

3 結論

以豬肉為研究對象，建立了噁唑菌酮的分析測定方法。樣品經1%酸化乙腈提取，經旋轉蒸發儀濃縮后加水混勻，經Oasis PRIME HLB柱凈化，HPLCMS/MS分析。該方法前處理操作簡便，靈敏度高，適用于豬肉中噁唑菌酮的檢測和確證，為我國檢測動物源產品中噁唑菌酮的殘留量提供參考。