奶粉中菌落總數(shù)測定能力驗證與分析

◎ 許 程，夏 輝，張志然，楊雪梅，劉海明，王雪梅，牟冠霖

（煙臺市標(biāo)準(zhǔn)計量檢驗檢測中心，山東 煙臺 264003）

菌落總數(shù)是微生物檢驗的主要內(nèi)容，可以表明該食品被污染的狀況，可以預(yù)測食品可存放時間，可以預(yù)估出食品腐敗情況[1]。一般來講，菌落總數(shù)越多，被污染的程度就越嚴(yán)重，食品耐放時間越短，也更容易加速食品腐敗變質(zhì)的進(jìn)程，甚至可能引起食用者出現(xiàn)食物中毒等不良反應(yīng)，因此檢測食品中菌落總數(shù)對保證食品安全具有重要意義。

目前我國菌落總數(shù)測定的標(biāo)準(zhǔn)有《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）、《食品和動物飼料微生物學(xué)30 ℃菌落計數(shù)方法》（SN/T 1800—2006）、《進(jìn)出口食品中菌落總數(shù)計數(shù)方法》（SN/T 0168—2015）、《食品和化妝品中的菌落計數(shù)檢測方法 螺旋平板法》（SN/T 2098—2008）和《出口飲料中菌落總數(shù)、大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌計數(shù)方法 疏水柵格濾膜法》（SN/T 1607—2017）等[2]。目前菌落總數(shù)的測定技術(shù)有國標(biāo)法、快速紙片法，而隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多光譜成像法、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜也被應(yīng)用于菌落總數(shù)的測定[3-6]。

能力驗證是檢驗機(jī)構(gòu)外部質(zhì)量控制的一種方法[7]。按照《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（ISO/IEC 17025：2017），認(rèn)證機(jī)構(gòu)都需要參與能力驗證，并且對參加頻次也有相關(guān)規(guī)定。微生物能力驗證的檢測范圍涉及沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、阪崎腸桿菌、霉菌酵母和菌落總數(shù)等[8-9]。通過能力驗證，一個檢驗機(jī)構(gòu)或?qū)嶒炇铱梢哉故酒錂z測能力，可以提高客戶對檢驗機(jī)構(gòu)的信任度。此外，檢驗機(jī)構(gòu)或?qū)嶒炇铱梢砸矐?yīng)該使用能力驗證結(jié)果來檢查其工作各方面是否達(dá)標(biāo)，并得出持續(xù)改進(jìn)其工作質(zhì)量的措施。

為了解機(jī)構(gòu)質(zhì)量控制舉措是否到位，保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，本機(jī)構(gòu)參加了山東省計量科學(xué)研究院組織的奶粉中菌落總數(shù)測定能力驗證，按照作業(yè)指導(dǎo)書和國家標(biāo)準(zhǔn)的要求對編號為B04的奶粉樣品進(jìn)行檢驗，并通過人員比對、多稀釋度等方式進(jìn)行質(zhì)量控制，保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過此次能力驗證，機(jī)構(gòu)分析了菌落總數(shù)能力驗證質(zhì)量控制情況及注意事項，并進(jìn)行經(jīng)驗總結(jié)，為其他項目的檢驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品編號為B04，出自山東省計量科學(xué)研究院。平板計數(shù)瓊脂（Plate Count Agar，PCA）（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；0.85%生理鹽水（實驗室氯化鈉配制）。所有培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)，并通過了國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》驗收。

1.2 儀器設(shè)備

GR85DA高壓蒸汽滅菌鍋（致微（廈門）儀器有限公司）；HH-6電子溫控恒溫水浴鍋（金壇中大儀器廠）；GNP-9160恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；BSC-1360 Ⅱ B2生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；Lab ancer漩渦混勻器（德國IKA公司）。

1.3 檢驗人員

檢驗人員X（工齡10年）、檢驗人員C（工齡3年）參與檢驗。

1.4 檢驗方法

按照山東省計量科學(xué)研究院下發(fā)的作業(yè)指導(dǎo)書和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）的要求測定。

1.5 操作步驟

（1）樣品處理及樣品稀釋。每瓶樣品按照1 g稱量后分裝，作為獨立檢測單元，無需再稱量取樣，計算時按照1 g計算。樣品需從冰箱中取出在室溫下放置5 min，在生物安全柜中打開西林瓶，復(fù)溶后進(jìn)行定量檢測。每瓶樣品直接加入9 mL滅菌稀釋液，復(fù)溶后得到1∶10稀釋度的樣品勻液，然后進(jìn)行10倍系列稀釋，選擇適宜的稀釋度進(jìn)行定量檢測。

（2）培養(yǎng)、菌落計數(shù)、計算、報告。每個稀釋度取1 mL樣品勻液于3個無菌平皿中，平板傾注PCA培養(yǎng)基，混勻，凝固后倒置，36 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。同時做空白對照。菌落計數(shù)、計算、報告按照GB 4789.2—2016中第6.3條和第7條進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板觀察和計數(shù)

圖1 為兩位檢測人員X、C分別對樣品B04檢測結(jié)果圖，可以明顯觀察到樣品在10-4稀釋度的PCA平板上的菌落形態(tài)。

在PCA平板上的菌落數(shù)量圖

由圖1可知，菌落為白色圓形，光滑且質(zhì)地均勻。選取菌落數(shù)在30～300 CFU的平板，分別計數(shù)。結(jié)果如表1所示。由表1可知，樣品B04在10-4和10-5稀釋度的平板符合30～300 CFU計數(shù)要求，10-1、10-2和 10-3稀釋度的平板上的菌落數(shù)超過300 CFU計為“多不可計”，而在10-6稀釋度的平板上發(fā)現(xiàn)無菌落生長，同時空白平板上沒有菌落生長，表明檢驗過程中無菌控制情況良好。

表1 B04平板計數(shù)檢驗結(jié)果表

2.2 人員比對實驗

檢驗結(jié)果參考《食品和動物飼料微生物學(xué)30 ℃菌落計數(shù)方法》（SN/T 1800—2006）及《食品微生物學(xué)微生物計數(shù)水平法.第1部分：在30 ℃條件下利用傾注平皿技術(shù)進(jìn)行菌落計數(shù)》（ISO 4833-1：2013），根據(jù)結(jié)果重復(fù)性和再現(xiàn)性的計數(shù)要求，同一人員檢驗結(jié)果對數(shù)值間的絕對差值≤重復(fù)性限R=0.25，不同人員檢驗結(jié)果對數(shù)值間的絕對差值小于等于再現(xiàn)性R=0.45[10]。

由表2可知，人員X和人員C的檢驗結(jié)果分別為1.37×104CFU·g-1和1.35×104CFU·g-1，2名檢驗人員的實驗結(jié)果的對數(shù)值的絕對差值為0.007，絕對差值不大于0.45，檢驗結(jié)果滿足再現(xiàn)性要求；人員X第2次、第3次檢驗結(jié)果的對數(shù)值為6.164、6.114，與第1次檢驗結(jié)果相比，對數(shù)值絕對差值分別為0.034、0.016，滿足不大于0.25的標(biāo)準(zhǔn)要求；人員C第2次、第3次檢驗結(jié)果的對數(shù)值為6.110、6.150，與第1次檢驗結(jié)果相比，對數(shù)值絕對差值分別為0.030、0.010，滿足不大于0.25的標(biāo)準(zhǔn)要求，兩名人員的檢驗結(jié)果滿足重復(fù)性要求。綜上所述，兩位檢驗人員的能力滿足檢驗要求。

表2 人員比對測定結(jié)果與數(shù)據(jù)處理表

2.3 實驗結(jié)果的確定與評價

綜合兩名檢驗人員數(shù)據(jù)，本次能力驗證B04菌落總數(shù)報出值為1.4×104CFU·g-1。本次能力驗證共有30多家機(jī)構(gòu)參與，本機(jī)構(gòu)結(jié)果評價為滿意。

3 結(jié)論與討論

本實驗室參加了山東省計量科學(xué)研究院組織的奶粉中菌落總數(shù)測定能力驗證，并按照作業(yè)指導(dǎo)書和國家標(biāo)準(zhǔn)的要求對編號為B04奶粉樣品進(jìn)行處理、培養(yǎng)、計數(shù)，最終上報編號B04奶粉菌落總數(shù)為1.4×104CFU·g-1，結(jié)果評價為滿意，表明本機(jī)構(gòu)具有菌落總數(shù)測定的檢測能力。同時本機(jī)構(gòu)利用人員比對、多稀釋度、平行樣等方式進(jìn)行質(zhì)量控制，保證了檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

外部質(zhì)量控制可以用來評測管理體系的有效性、檢驗人員業(yè)務(wù)能力以及評測檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，能力驗證是外部質(zhì)量控制的一種方式，檢驗機(jī)構(gòu)要正確的利用能力驗證的結(jié)果，不只要關(guān)心能力驗證結(jié)果的滿意度，更要關(guān)注實施機(jī)構(gòu)提供的報告分析和建議，及時發(fā)現(xiàn)問題，及時整改，這樣才能全方面提升檢驗機(jī)構(gòu)的技術(shù)能力。為了提升能力驗證的滿意度，檢驗人員可以從以下幾點加強(qiáng)質(zhì)量控制。

3.1 樣品管理

樣品接收時要檢查包裝的密封性和樣品標(biāo)識的完整性，每一份樣品均有獨立、唯一的編號；樣品接收時立即檢查樣品狀態(tài)，如有破損或其他情況，及時和組織方聯(lián)系溝通，能夠節(jié)省不少時間；實驗室收到樣品后應(yīng)盡快完成檢測，檢測前將樣品充分混勻，開封后的樣品要冷凍保存[11]。作業(yè)指導(dǎo)書的閱讀要到位，這其中往往會對本次能力驗證的樣品、檢驗項目、檢驗方法、檢驗結(jié)果記錄及照片、數(shù)據(jù)修約、結(jié)果報告及寄發(fā)的注意事項等有明確的規(guī)定。

3.2 人員素質(zhì)

微生物檢驗中人員是保證檢驗數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確性的決定性因素，是整個檢驗過程的執(zhí)行者，檢驗人員的業(yè)務(wù)技能、業(yè)務(wù)素質(zhì)直接決定了檢驗質(zhì)量。在進(jìn)行能力驗證時，可利用人員比對的方式，既可以進(jìn)一步保證報出值的準(zhǔn)確度及結(jié)果滿意度，又可對檢驗人員進(jìn)行能力評價及內(nèi)部考核[12]。

3.3 儀器設(shè)備

儀器設(shè)備是檢驗檢測工作的武器，武器質(zhì)量的好壞決定了數(shù)據(jù)的可靠性。菌落總數(shù)測定需要用到的儀器設(shè)備有滅菌鍋、天平、培養(yǎng)箱、顯微鏡和菌落計數(shù)器等，其中滅菌鍋主要對培養(yǎng)基及實驗所用到的器具進(jìn)行滅菌處理，所以在進(jìn)行能力驗證前要利用化學(xué)指示卡和生物指示劑法進(jìn)行滅菌效果評價，保證檢驗品、培養(yǎng)基滿足無菌要求；恒溫培養(yǎng)箱要有相應(yīng)的計量證書、操作規(guī)程及受控標(biāo)識，并且要監(jiān)控培養(yǎng)溫度否滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。

3.4 耗材質(zhì)量

檢驗過程中所用到的培養(yǎng)基、試劑、標(biāo)準(zhǔn)菌株的優(yōu)劣直接決定了檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此在日常工作中必須要做好試劑耗材的質(zhì)量控制[13]。培養(yǎng)基要按照國標(biāo)的規(guī)定進(jìn)行驗收，除了物理性驗收，還要利用質(zhì)控菌株和參比培養(yǎng)基進(jìn)行生長率測定，質(zhì)控評定標(biāo)準(zhǔn)為生長率≥0.7。食品微生物檢驗對無菌環(huán)境的控制非常重要，所以在進(jìn)行菌落總數(shù)測定能力驗證時，檢驗人員必須更換隔離服，戴好手套、鞋套、口罩、頭套和防護(hù)鏡等用品方可進(jìn)入實驗區(qū)域，同時要對實驗區(qū)域進(jìn)行紫外、新潔爾滅、75%酒精消毒，完成潔凈區(qū)確認(rèn)。

3.5 檢驗流程

菌落總數(shù)測定中，整個檢驗流程的質(zhì)量控制也不容忽視。①開啟西林瓶前要對其進(jìn)行表面消毒，同時對剪刀等用具進(jìn)行灼燒滅菌。②檢驗所用到的稀釋液建議統(tǒng)一滅菌后進(jìn)行9 mL分裝，保證稀釋液體積的準(zhǔn)確性。若使用直接滅菌，要注意滅菌后稀釋液的體積變化。③培養(yǎng)基凝固后可以覆蓋一層，避免菌落成片，無法計數(shù)。④培養(yǎng)基的量也要把握好，在加入樣品液后要充分混勻，混勻的速度要慢，避免培養(yǎng)基撒漏，造成結(jié)果不準(zhǔn)確或樣品交叉污染。⑤考慮到能力驗證結(jié)果的重要性，可利用質(zhì)控樣進(jìn)行同步檢驗，依據(jù)質(zhì)控樣的結(jié)果，檢驗稀釋液體積、檢驗過程操作、培養(yǎng)基體積、培養(yǎng)條件等是否合適[14]。