馬鈴薯酒的HPLC指紋圖譜研究

◎ 林 巧，蘇姣姣，劉軍華，李 成，張 忠，蔡 利，舒一梅

（1.西昌學(xué)院，四川 西昌 615000；2.涼山州天美益農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 西昌 615000；3.新希望集團西昌希望飼料公司，四川 西昌 615000）

指紋譜圖是一種多方位、全面的、可量化的綜合檢測技術(shù)，其通過一系列的分析手段獲得具有專一性、代表性和特征性的色譜或光譜[1]，在鑒別產(chǎn)品真?zhèn)畏矫姘l(fā)揮著一定的作用[2]。現(xiàn)在，在食品行業(yè)里HPLC指紋圖譜技術(shù)已得到合理的運用，尤其是在中藥領(lǐng)域，指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用且取得重大成就[3]。此外，指紋圖譜在白酒質(zhì)量控制上也具有一定的意義[4]。研究表明，在某些白酒生產(chǎn)加工過程中，以指紋圖譜為依據(jù)可以有效地解決白酒中成分復(fù)雜、不定性的問題[5]，再進行嚴(yán)格地監(jiān)督和合理地指導(dǎo)，就可以保證白酒質(zhì)量的穩(wěn)定性。然而，上述指紋圖譜作用是否對馬鈴薯白酒同樣有效是值得考查和研究的，建立其指紋圖譜也是極具意義的。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇溶液出自成都市科隆化學(xué)品有限公司，其純度大于99.7%；冰乙酸為色譜純；乙酸正丁酯為羅恩試劑，其純度大于99.0%；10個批次的馬鈴薯酒。

安捷倫1260高效液相色譜儀，真空過濾裝置，超聲裝置，安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱。

1.2 實驗條件

色譜流動相為0.5%的乙酸（A），甲醇（B）；選擇以下梯度條件分離：25%的A和75%的B（10 min），45%的A和55%的B（15 min），65%的A和35%的B（25 min）；選擇安捷倫色譜柱；流速為0.8 mL·min-1，柱溫左右均為30 ℃，進樣量為20 μL，檢測波長為290 nm。

1.3 樣品處理

取各批次的馬鈴薯酒25 mL到50 mL的容量瓶中，隨后加入5 mL內(nèi)標(biāo)液（乙酸正丁酯[6-7]），再用60%的甲醇水溶液定容至容量瓶刻度線處，搖晃混合均勻后，樣品溶液用0.45 μm的微孔濾膜過濾，最后取溶液到樣品瓶內(nèi)用于后續(xù)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 馬鈴薯酒HPLC指紋圖譜的獲取

為使馬鈴薯酒樣各成分能夠充分地分離，通過一系列的預(yù)實驗以及優(yōu)選合適的流動相比例以確定最優(yōu)的條件。在檢測波長為290 nm時，得到的圖譜基線平穩(wěn)且色譜峰較豐富，所以該試驗的檢測波長確定為290 nm。在高相液相色譜儀中將配制好的馬鈴薯酒樣溶液運行60 min后，發(fā)現(xiàn)獲得的圖譜在15 min后基線平穩(wěn)且不再有組分色譜峰出現(xiàn)，故色譜檢測時間確定為15 min。

2.1.2 馬鈴薯酒HPLC指紋圖譜的穩(wěn)定性試驗

將10個批次的馬鈴薯酒按照1.3樣品處理步驟配制成10份酒樣溶液，再根據(jù)優(yōu)選的色譜條件進樣檢測得到它們的指紋圖譜，并計算各色譜峰相對于參照峰（乙酸正丁酯峰）的相對保留時間和相對峰面積，及對應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），探究高效液相色譜法指紋圖譜的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，這10個批次的馬鈴薯酒的相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.2%～0.3%，相對峰面積的RSD在0.5%～2.0%，所以這10批馬鈴薯酒樣的穩(wěn)定性良好。

2.1.3 馬鈴薯酒HPLC指紋圖譜的精密度試驗

為了考查HPLC指紋圖譜的精密度，把每一批次的馬鈴薯酒按照1.3樣品處理步驟配制為樣品溶液1份，每一份樣品溶液都需在高效液相色譜儀中連續(xù)進樣6次。根據(jù)色譜圖中的保留時間和峰面積來計算各組分色譜峰相對于參照峰的相對保留時間和相對峰面積。通過計算和分析，整理得到表1，結(jié)果表明酒樣色譜峰相對保留時間的RSD在0.080%～0.80%，相對峰面積的RSD在0.2%～0.9%，由此可知這10批馬鈴薯酒的指紋圖譜精密度良好。

表1 酒樣進樣6次的相對保留時間和相對峰面積表

續(xù)表1

2.1.4 馬鈴薯酒HPLC指紋圖譜的重復(fù)性試驗

為考查HPLC指紋圖譜的重復(fù)性，將每一批次馬鈴薯酒按照1.3樣品處理步驟制備成6份。將6份酒樣溶液標(biāo)號1、2、3、4、5、6，再進樣并得到色譜圖。選擇色譜圖的保留時間和峰面積來計算各組分色譜峰相對于參照峰的相對保留時間和相對峰面積。經(jīng)過數(shù)據(jù)整理和分析得到表2，結(jié)果表明各組分色譜峰相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.08%～0.60%，相對峰面積的RSD為0.20%～0.80%，由此可知這10批馬鈴薯酒的重復(fù)性良好。

表2 10個批次酒樣重復(fù)性試驗的相對保留時間和相對峰面積表

2.2 馬鈴薯酒HPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 馬鈴薯酒試劑空白圖譜

將配制馬鈴薯酒樣品的溶劑作為空白試劑，然后按照色譜條件檢測并得到空白圖譜。圖1為按照上述步驟得到的空白圖譜，由圖可知基線平穩(wěn)，故配制酒樣的溶劑不干擾供試品的檢測。

圖1 空白圖譜圖

2.2.2 馬鈴薯酒樣品指紋圖譜

按照1.3的樣品處理步驟將10個不同批次的馬鈴薯酒配制成待測樣品，經(jīng)過進樣檢測獲得它們的高效液相指紋圖譜。通過比較、分析這些HPLC指紋圖譜，獲得有效的數(shù)據(jù)——保留時間、峰高和峰面積，并提取它們的共有峰建立最終的馬鈴薯酒指紋圖譜。

2.3 指紋圖譜分析

2.3.1 相對保留時間和相對面積的計算

相對保留時間為T=t1/t2，其中，t1為某個待測組分峰的保留時間，t2為參照峰的保留時間。相對峰面積為S=A1/A2，其中，A1為某個待測組分峰的峰面積，A2為參照峰的峰面積。

2.3.2 共有指紋峰的標(biāo)定

從10個批次馬鈴薯酒的HPLC色譜圖中提取相同或相似的組分峰，最終將色譜峰中6個共有組分峰作為馬鈴薯酒HPLC指紋圖譜的特征峰。代入到上述2.3.1的公式，分別計算這10批馬鈴薯酒樣中6個共有峰相對于參照峰的相對保留時間的平均值，它們分別為0.703 2、0.850 7、0.897 9、0.931 8、1.000 0（參照峰）、1.269 9，以上5個峰被選擇為指紋圖譜的特征峰，對此類馬鈴薯白酒產(chǎn)品質(zhì)量鑒別具有一定的意義。結(jié)果分析整理見圖2和表3。

圖2 馬鈴薯酒指紋圖譜圖

表3 10批酒樣5個共有峰的相對保留時間和相對峰面積表

2.3.3 指紋圖譜相似度評價

將10個批次馬鈴薯酒樣的高效液相色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入到《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（中國國家藥典委會，2012.130723版本）。運用此系統(tǒng)對10批酒樣進行相似度評價，10個批次馬鈴薯酒的HPLC指紋圖譜見圖3，相似度評價結(jié)果見表4。

由圖3馬鈴薯酒的HPLC指紋圖譜可以直觀地看出這10個批次的酒樣在多個色譜峰具有明顯地重合，這說明馬鈴薯酒色譜峰具有較好的一致性。表4馬鈴薯酒的相似度分析結(jié)果表明，這10個批次酒樣指紋圖譜的相似度均在0.953之上，馬鈴薯酒樣之間的相似度也在0.926之上。通過以上一系列分析可知，這10批馬鈴薯酒質(zhì)量較穩(wěn)定且具有良好的一致性，所以建立的馬鈴薯酒指紋圖譜具有一定的信服力。

表4 馬鈴薯酒樣相似度分析表

圖3 馬鈴薯酒指紋圖譜相似度評價結(jié)果圖

2.4 馬鈴薯酒指紋圖譜的驗證試驗

為探究馬鈴薯酒指紋圖譜的可行性，準(zhǔn)備兩種類型的酒樣，分別是馬鈴薯酒、北京二鍋頭。兩種白酒分別按照1.3樣品處理步驟配置成酒樣并在相同的條件下進樣檢測，并將得到的兩個色譜峰重疊到一個圖，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，位于下面的色譜圖與馬鈴薯酒指紋譜圖相似且多處共有峰重疊較吻合，而位于上面的色譜圖與馬鈴薯酒指紋圖譜差異較大，以此區(qū)分出了馬鈴薯酒和北京二鍋頭，所以馬鈴薯酒指紋圖譜具有可行性且較為可靠。

圖4 馬鈴薯酒和北京二鍋頭HPLC指紋圖譜的重疊圖

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過對指紋圖譜數(shù)據(jù)的整理和分析得到了各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。通過對比10個批次馬鈴薯酒樣品相對保留時間和相對峰面積的差異，對10個批次的馬鈴薯酒做了相似度評價。結(jié)果表明，通過對10批馬鈴薯酒的指紋圖譜優(yōu)化5個共有特征峰，并且它們的相似度在0.926以上，說明相似度差異較小。目前指紋圖譜在中藥領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，而本次試驗得到的馬鈴薯酒HPLC指紋圖譜能夠發(fā)現(xiàn)馬鈴薯酒的特征峰，能夠反映該酒的整體組分情況。

本實驗通過一系列的操作、分析，優(yōu)選試驗條件和優(yōu)化試驗步驟流程最終獲得了馬鈴薯酒的指紋圖譜，且一系列驗證試驗結(jié)果表明高效液相色譜法用于馬鈴薯酒指紋圖譜的研究是方便可靠的、易行的，高效液相色譜法可以方便且有效地用于馬鈴薯酒的質(zhì)量控制和摻偽檢驗，而此方法是否能用于其他白酒或其他領(lǐng)域還有待進一步研究。