超高效液相色譜-串聯質譜法測定侗族腌魚中硝基呋喃代謝物殘留量

◎ 龍姜柳，管春成，劉桂瓊，楊 坤

（黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556012）

腌魚是貴州省黔東南州侗族地區特色傳統發酵美食，稻田鯉魚、草魚通過食鹽腌制后，加入醪糟、白酒、生姜、花椒等輔料混合均勻，放入壇內密封自然發酵3個月以上而成的特色魚制品[1-3]。因其有助消化、含人工無法合成的氨基酸和特色風味等特點，深受當地人們的喜愛。

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，對大多數真菌和病毒具有較好的殺滅作用，且價格低廉，在水產養殖領域被廣泛用于治療由大腸桿菌或沙門氏菌所引發的疾病[4-6]。因硝基呋喃原藥在動物體內代謝快，半衰期短，檢測其原藥不足以反映真實的殘留情況，因此檢測其代謝物成為當前國內外研究的熱點[7-14]。

目前，我國水產品檢測硝基呋喃代謝物殘留的國家標準[15-16]主要采用乙酸乙酯提取，正己烷除脂，凈化效果差，有很強的基質干擾，在檢測成分更加復雜的侗族腌魚時目標化合物基質效應嚴重，嚴重影響檢測結果的準確度。倪楊等[17]采用QuEChERS法凈化，凈化效果優于正己烷，但該方法僅在蜂蜜樣品上驗證，并未對魚等水產品樣品進行試驗。因此，本文采用QuEChERS法研究建立快速凈化復雜樣品——侗族腌魚基質中硝基呋喃代謝物的前處理方法，同時為魚類等水產品中硝基呋喃代謝物的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腌魚樣品：5批次購于錦屏縣，3批次購于黎平縣，3批次購于從江縣，2批次購于榕江縣，4批次購于凱里市。

呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃妥因（AHD）和呋喃西林（SEM）（100 μg·mL-1，壇墨質檢）；4種硝基呋喃代謝物同位素內標（100 μg·mL-1，壇墨質檢）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；鹽酸（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；2-硝基苯甲醛（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸鉀（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；QuEChERS獸藥提取包和凈化管（日本島津公司），水為實驗室自制超純水。

1.2 儀器與設備

AB 4000+型液質聯用系統（配電噴霧離子源（ESI），Analyst1.6.3數據處理軟件，美國應用生物系統公司）；Agilent 1290型液相色譜儀（配二元高壓泵，自動進樣器，美國安捷倫公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（美國Waters公司）；Milli-Q純水機（美國Millipore公司）；ML104電子天平（感量0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多（上海）儀器公司）；3-18k型高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；KQ-700DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

剔除魚頭和刺，取魚肉切成小塊，充分勻漿，保存于-18 ℃，備用。稱取2.00 g樣品于50 mL離心管中，加入0.2 mol·L-1鹽酸溶液10.0 mL，2 000 r·min-1振蕩2 min，加入2-鄰硝基苯甲醛溶液0.10 mL，內標物質0.10 mL。于60 ℃水浴上加熱2 h，取出樣品冷卻至室溫，加0.3 mol·L-1磷酸鉀溶液1 mL，用2.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節pH值至7.4±0.2。加入10.0 mL乙腈溶液，搖勻，加入QuEChERS鹽包，渦旋1 min，于8 000 r·min-1下4 ℃離心5 min。吸取上清液于QuEChERS凈化管中，搖勻，靜置2 min，取上清液1.00 mL于10 mL玻璃瓶中40 ℃氮吹至近干，用1.00 mL初始流動相復溶，過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。流動相A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；流速為0.30 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min，90%A；3.0～4.0 min，50%A；4.1～6.0 min，90%A。

（2）質譜條件。電噴霧正離子電離模式（ESI+），去溶劑溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣壓力（CUR）：172 kPa；碰撞氣壓力（CAD）：41 kPa；離子氣1壓 力（GS1）：414 kPa；離 子 氣2壓 力（GS2）：379 kPa；離子噴射電壓（IS）：5 500 V；掃描方式：多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式。以子母離子的保留時間和豐度比定性，以峰面積定量。

1.4 基質標準曲線配制

向腌魚陰性樣品中分別添加濃度為1.00 μg·L-1、2.00 μg·L-1、4.00 μg·L-1、6.00 μg·L-1、10.00 μg·L-1和20.00 μg·L-1的4種硝基呋喃代謝物混合標液，按照1.3.1項前處理方法測定，以標準工作液質量濃度為橫坐標，標準工作液響應值與其內標響應值之比為縱坐標，制作標準工作曲線，內標法定量。

1.5 加標回收實驗

向腌魚陰性樣品（樣品未檢出）按方法1.3.1方法處理中分別添加100 μL、300 μL、500 μL質量濃度為100 μg·L-1硝基呋喃代謝物混合液（0.005 mg·kg-1、0.015 mg·kg-1和0.025 mg·kg-1濃度水平），平行測試6次，并計算檢出限、精密度和回收率。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理優化

2.1.1 衍生時間和溫度的優化

分別在40 ℃、50 ℃和60 ℃環境下衍生1 h、2 h、3 h、4 h和5 h對4種硝基呋喃代謝物進行衍生對比，結果見圖1。從圖1可知，在60 ℃下衍生2 h的平均回收率大于97%，因此選擇在60 ℃下衍生2 h。

圖1 衍生溫度和衍生時間對4種硝基呋喃代謝物的影響圖

同時，分別對衍生后的標準溶液進行間隔20 h、44 h、66 h重復測試，其檢測結果與衍生后馬上測試值偏差均小于5%，因此，4種硝基呋喃衍生物衍生后穩定性效果較好。

2.1.2 衍生劑用量的優化

按照1.3.1方法分別選擇用2-鄰硝基苯甲醛0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL和0.40 mL對4種硝基呋喃代謝物進行衍生，結果見圖2。SEM使用0.30 mL衍生劑峰面積最大，AOZ在0.05 mL衍生劑下峰面積最大，AHD和AMOZ在0.10 mL衍生劑峰面積最大。因此，選擇加入2-鄰硝基苯甲醛0.10 mL衍生劑。

圖2 衍生劑用量對4種硝基呋喃代謝物的影響圖

2.2 儀器條件的優化

2.2.1 質譜條件優化

對硝基呋喃類代謝物混合標準溶液進行衍生化處理，得到NP-AOZ、NP-SEM、NP-AHD和NP-AMOZ混合標準溶液，將該混合標準溶液通過針泵以流動注射的方式在電噴霧模式下進行母離子和子離子掃描，并優化去簇電壓、碰撞能量等參數條件，以達到最佳靈敏度。優化后的質譜條件如表1所示。

表1 4種硝基呋喃代謝物及其內標物質質譜參數表

2.2.2 液相條件優化

倪 楊等[17]對BEH C18、HILIC和HSS T3 3種不同型號的柱子進行測試，發現BEH C18柱對其分離效果好，高海波等[18]也選用BEH C18柱作為分離柱。因此，本文選用Waters BEH C18柱作為分離柱。

采用乙腈-水、乙腈-水（含0.1%甲酸）、乙腈-水（含5 mmol·L-1乙酸銨）和乙腈-水（含5 mmol·L-1乙酸銨、0.1%甲酸）流動相體系優化。在梯度洗脫條件下，采集時間6 min，流速0.30 mL·min-1，柱溫35 ℃條件下，發現乙腈-水（含0.1%甲酸）作為流動相使目標物離子化提高，峰形尖銳。在MRM模式下測定，侗族腌魚基質中添加2 ng·mL-1的4種硝基呋喃類代謝物混合標樣的色譜圖見圖3。

圖3 侗族腌魚基質加標的4種硝基呋喃代謝物的內外標多反應檢測色譜圖

2.3 基質效應的影響

基質效應是分析過程中由待測物以外的其他物質的存在直接或者間接影響待測物響應，造成嚴重干擾，影響分析結果的準確性。按“1.4”方法配制腌魚基質匹配標準溶液及流動相初始溶液配制標準溶液，按公式（1）計算基質效應（ME）：

式中：K1和K2分別表示基質匹配標準曲線斜率和純溶劑標準曲線斜率，ME越接近1，則基質效應越小。

4種硝基呋喃代謝物在腌魚中的基質效應見圖4。結果顯示，硝基呋喃代謝物在腌魚基質中只有呋喃西林代謝物存在較小的基質抑制效應，其他3種呋喃代謝物在腌魚基質中不存在明顯的基質增強效應。因此，本實驗采用基質匹配的標準溶液來定量，以抵基質效應的干擾。

圖4 侗族腌魚4種硝基呋喃代謝物的基質效應圖

2.4 方法學評價

在優化的UPLC-MS/MS分析條件下，按照1.3.2中的條件對基質標準曲線進行檢測。4種硝基呋喃代謝物在一定質量濃度范圍內與對應的峰面積呈良好的線性關系，相關系數為0.999 81～0.999 97，以定量離子3倍信噪比（S/N=3）得到檢出限（LOD）為0.5～1.0 μg·kg-1，以 定 量 離 子10倍 信 噪 比（S/N=10）得到定量下限（LOQ）2.0～3.0 μg·kg-1，侗族腌魚4種硝基呋喃代謝物的標準曲線和相關系數見表2。

表2 線性方程、相關系數、檢出限和定量限表

2.5 回收試驗

按試驗方法對空白侗族腌魚樣品進行加標回收 試 驗，加 標 量 為0.005 mg·kg-1、0.015 mg·kg-1、0.025 mg·kg-1，平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表3。侗族腌魚3水平添加回收率為97.48%～106.7%，RSD為1.47%～5.64%。

表3 回收試驗結果表（n=6）

2.6 樣品分析

按上述試驗方法對17批次腌魚進行測試，均未發現4種硝基呋喃代謝物殘留量。

3 結論

本文采用超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定侗族腌魚中4種硝基呋喃殘留量，通過優化前處理方法，大大縮短了衍生時間，為快速檢測分析提供了可能。本方法操作簡單，衍生穩定性好，無需固相萃取柱凈化，結果準確度高，重現性好，是一種簡便、快速和高效的測定方法，適用于侗族腌魚產品中硝基呋喃代謝物殘留量的測定。