功能性工程米對斑馬魚酒精性肝損傷的保護作用

◎ 杜玉蘭，嚴建剛，毛新亮，吳曉春，柳 嘉，段盛林，李曉敏

（1.完美（廣東）日用品有限公司，廣東 中山 528400；2.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；3.廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山 528400）

肝臟是人體功能最多、最復雜的，也是參與食物代謝最重要的器官，在身體里扮演著去氧化、儲存糖原及合成蛋白質、膽汁等作用。肝臟損傷時會導致糖耐量降低、蛋白質和脂類代謝紊亂、水和電解質紊亂、三酰甘油增多、血氨增高及凝血功能障礙等問題[1]，所以肝病一直以來都是危害人類健康的一大殺手。

市場上也研制成功出一些護肝的保健食品和藥品，不過目前此類產品多數效果不明顯，或者有毒副作用，存在一定的市場局限性。完美（中國）有限公司與中國食品發酵工業研究院合作，經過多年深入研究開發出一款具有高蛋白且富含洛伐他丁、原花青素、黃酮類等活性成分的功能米。因此，本研究利用斑馬魚酒精肝損傷模型測定和比較斑馬魚肝臟脂肪光密度及功能米保肝護肝作用，明確完美（中國）有限公司研發的功能米保肝、護肝的功效。

斑馬魚是一種脊椎動物亞門輻鰭魚綱鯉科的小型魚類，具有飼養方便、繁殖能力強、胚胎透明、能在顯微鏡下進行實時觀察等特點，最重要一點是其基因序列與人類基因序列保持高度的相似性[2]，其心血管系統、視覺系統、肝臟等消化系統以及神經系統等的發育機制和特點都與人類極其相似[3]。斑馬魚也被美國食品藥品監督管理局（FDA）列為繼人和嚙齒類鼠之后的第三大模式生物，已廣泛應用于生命科學研究和藥物篩選中[4-5]。本研究利用1%無水乙醇斑馬魚酒精肝損傷模型，通過Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件進行圖像分析，計算斑馬魚肝臟脂肪光密度、保肝作用，評價樣品保肝、護肝功效。此評價方法成本低、耗時短、簡單、直觀，對以后評價樣品保肝、護肝作用有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚，以自然成對交配方式進行繁殖。年齡為受精后5 d，飼養于28 ℃的養魚用水中（水質：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為480～510 μS·cm-1；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg·L-1CaCO3），實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171。飼養管理符合國際AAALAC認證的要求。

1.2 樣品與試劑

1.2.1 樣品

完美牌幸馥稻（宜甘）樣品（簡稱RD045-01功能性工程米）：完美牌幸馥稻（宜甘）是以糙米、大豆分離蛋白、葛根提取物、玉米肽、山楂粉、紫薯粉和黑米粉等為主要原料制成的紫色、米形功能米，樣品用粉碎機打成粉末后用純水配制成50 mg·mL-1母液，搖床上下混勻1 h后，離心取上清用作功效評價，用養魚用水按需稀釋。

RU-21安體普解酒片，白色片劑，購自Spirit Sciences USA，臨用時用純水配制成100 mg·mL-1的母液備用，用養魚用水按需稀釋。

1.2.2 試劑

無水乙醇、甲基纖維素，購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；油紅O，購自Sigma；4%多聚甲醛，購自鼎國生物。

1.3 儀器與設備

SZX7解剖顯微鏡（Olympus）、TK-C1481EC顯微鏡相連的相機、CP214精密電子天平（Ohaus）。

1.4 動物模型的建立

用1%的無水乙醇處理5 dpf黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚30 h，建立斑馬魚酒精性脂肪肝模型。

1.5 RD045-01功能性工程米對斑馬魚身體狀況的影響

隨機選取180尾受精后5 d（5 dpf）黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚于六孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚，用1%的無水乙醇誘發斑馬魚酒精性脂肪肝。分別水溶給予RD045-01（功能性工程米）500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1、1 500 μg·mL-1和2 000 μg·mL-1濃度，同時設置正常對照組（養魚用水處理斑馬魚）和模型對照組，每孔（實驗組）容量為3 mL。RD045-01（功能性工程米）與無水乙醇共同處理30 h后，觀察記錄斑馬魚的表型和死亡情況，根據斑馬魚的毒性反應和死亡情況確定RD045-01（功能性工程米）對酒精性脂肪肝模型斑馬魚身體狀況的影響。

1.6 RD045-01功能性工程米對斑馬魚酒精性脂肪肝保護作用

1.6.1 分組及給樣

隨機選取180尾受精后5 d（5 dpf）黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚于六孔板中，每孔（實驗組）30尾斑馬魚，用無水乙醇誘發斑馬魚酒精性脂肪肝。分別水溶給予RD045-01功能性工程米222 μg·mL-1、667 μg·mL-1和2 000 μg·mL-1濃度，陽性對照藥“RU21”50 μg·mL-1濃度，同時設置正常對照組（養魚用水處理斑馬魚）和模型對照組，每孔（實驗組）容量為3 mL。處理時間為30 h。

1.6.2 評價方法

實驗結束后，用油紅O進行染色，染色后每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照并采集數據，用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件進行圖像分析，計算斑馬魚肝臟脂肪光密度總和（S），并進行分析統計，根據統計學意義評價樣品肝保護作用，統計學處理結果用mean±SE表示，樣品肝保護作用計算公式如下：

1.6.3 統計學方法

用方差分析和Dunnett’s T-檢驗進行統計學分析，p＜0.05表明具有顯著性差異，p＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 RD045-01功能性工程米對斑馬魚身體狀況的影響

在實驗期間觀察期間斑馬魚的表型狀態良好，活動自如，無一尾斑馬魚死亡。說明RD045-01功能性工程米在2 000 μg·mL-1濃度及以下時，對酒精性脂肪肝模型斑馬魚未產生任何明顯的毒副作用，也未引起死亡。詳見表1。

表1 各實驗組對斑馬魚身體狀況的影響表（n=30）

2.2 RD045-01功能性工程米對無水乙醇誘發的斑馬魚酒精性脂肪肝的保護作用

斑馬魚用油紅O進行染色，在解剖顯微鏡下拍照分析，斑馬魚肝組織病理變化情況見圖1。

圖1 各實驗組對斑馬魚肝臟形態變化影響圖

用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件進行圖像分析，計算斑馬魚肝臟脂肪光密度總和（S），并進行分析統計，根據統計學意義評價樣品肝保護作用，統計學處理結果用mean±SE表示。處理數據匯總見表2。

表2 各實驗組對斑馬魚肝臟脂肪光密度總和及保肝護肝作用對比表（n=10）

由表2可知，模型對照組斑馬魚肝臟光密度總和（2 954像素）與正常對照組（997像素）相比差異性極顯著（p＜0.01），表明模型建立成功；陽性對照藥“RU21”50 μg·mL-1濃度組斑馬魚肝臟光密度總和為2 022像素，與模型對照組相比差異性極顯著（p＜0.01），其對斑馬魚保肝護肝作用為48%，說明“RU21”陽性對照藥對斑馬魚酒精性脂肪肝有保護作用；RD045-01功能性工程米222 μg·mL-1、667 μg·mL-1和2 000 μg·mL-1濃度組斑馬魚肝臟光密度總和分別為2 720、2 705和2 179像素，保肝護肝作用分別為12%、13%和40%，與模型對照組比較，222 μg·mL-1和667 μg·mL-1濃度組p＞0.05，2 000 μg·mL-1濃度組p＜0.01，表明RD045-01功能性工程米在2 000 μg·mL-1濃度條件下對斑馬魚酒精性脂肪肝有保護作用。對比分析詳見圖2和圖3。

圖2 各實驗組對斑馬魚肝臟光密度總和對比圖

圖3 各實驗組對斑馬魚肝保護作用對比圖

3 結論

本研究中的RD045-01功能性工程米是以糙米、大豆分離蛋白、紫薯粉、黑米粉為主要原料并添加葛根提取物、玉米肽、山楂提取物、紅曲米等功效成分，通過生物耦合擠壓重組技術制成的營養豐富，蒸煮后風味、形狀等與普通大米類似的一種工程米。通過斑馬魚實驗證明RD045-01功能性工程米對無水乙醇誘發的斑馬魚酒精性脂肪肝有保護作用，且呈劑量正相關性。其作用機理可能是RD045-01功能性工程米能增強體內乙醇代謝，減少肝損傷，恢復肝活力。