超聲輔助乙醇提取金銀花中黃酮化合物研究

◎ 白玲燕

（北京可佳食品配料有限公司，北京 100176）

金銀花又名忍冬、銀花[1]，屬忍冬科植物，是一種藥食兩用天然植物，具有清熱解毒、抗菌消炎、疏散風熱的功效[2]。金銀花中含有多種黃酮類化合物。木犀草素和忍冬苷等黃酮類化合物是金銀花的主要活性成分之一，具有抗自由基、抗氧化的作用，對人體的心血管系統有保護作用，可以防止動脈硬化、降低血脂和膽固醇、改善血管的通透性等，黃酮類化合物含量可以作為綜合分析該類藥材的質量指標[3]。測定金銀花中黃酮類化合物的含量對于金銀花的研究具有重要的意義。目前黃酮類物質常見的提取方法有水提、乙醇提、超聲法和酶解醇提法等[4-5]。本文采用超聲波輔助乙醇提取金銀花中的總黃酮，對其提取工藝進行響應面分析，得到最優提取條件，對金銀花深加工產業發展提供數據參考。

目前黃酮類物質提取效率較好方法是超聲輔助提取法。主要是利用超聲波的空化效應破壞細胞膜，促進黃酮類化合物的釋放與溶出，并且強化提取過程傳質作用[6]。超聲輔助提取屬于物理提取方法，無化學反應發生，最大限度地保存目標提取組分的生理活性。超聲輔助提取法具有操作簡單、提取時間短、提取效率高、節能環保、常溫提取不破壞熱敏性活性成分和成本低等優點，廣泛應用于中草藥有效成分提取。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

金銀花，購于福建省寧德旭升綜合農業開發有限公司；蘆丁標準品，購于中國藥品生物制品檢定所。

KQ-300VDE型三頻數控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；L-530型離心機，湖南湘儀儀器有限公司；UV-1750型紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.2 金銀花總黃酮得率的測定方法

以蘆丁對照標準品溶液，510 nm測定各濃度標樣的吸光值，繪制標準工作曲線。精密稱取5 g經過干燥粉碎后一定粉碎粒度的金銀花粉末于錐形瓶中，加入一定量的乙醇溶液，用超聲波清洗器在一定的功率和溫度下超聲一定時間，之后再將浸提液倒入離心管中，用離心機在4 000 r·min-1的條件下離心20 min，取一定量的上清液，用相應的乙醇溶液稀釋一定倍數，再移取12 mL稀釋液于50 mL容量瓶中，顯色后分別測定其吸光度值，然后通過標準工作曲線回歸方程計算各樣品中黃酮的含量。金銀花總黃酮的得率按公式計算：

式中：X-樣品中黃酮類化合物含量，%；C-依據標準曲線計算出被測液中黃酮濃度，μg·mL-1；m-樣品的質量，g；F-稀釋倍數；V-待測液的總體積，mL。

1.3 單因素試驗

研究超聲輔助乙醇提取因素對金銀花總黃酮得率的影響，主要考察金銀花粉碎粒度、乙醇的濃度、提取的次數、時間、溫度、料液比以及超聲功率等因素對黃酮類化合物得率的影響。固定其他因素不變，進行單因素試驗，單因素梯度設計如下。粉碎粒度：20目、40目、60目、80目 和100目；乙 醇 濃 度：10%、25%、40%、55%、70%、85%和100%；提取時間：10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min和70 min；提取溫度：20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃；料液比（g·mL-1）：1∶10、1∶25、1∶40、1∶55、1∶70和1∶85；超聲功率：120 W、150 W、180 W、210 W、240 W和270 W。

1.4 金銀花總黃酮提取工藝優化

分析單因素試驗結果并綜合考慮，根據Box-Benhnken（BBD）原理設計試驗，對金銀花中總黃酮提取條件進行工藝優化和響應面分析，以期得到最佳提取工藝參數。

1.5 數據分析

采用Design-Expert數據處理軟件進行試驗數據處理和結果分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

從不同單因素試驗的曲線圖1～圖6。A是不同粉碎粒度對金銀花總黃酮得率的影響。

圖1 粉碎粒度對金銀花總黃酮得率的影響圖

圖2 乙醇濃度對金銀花總黃酮得率的影響圖

圖3 提取時間對金銀花總黃酮得率的影響圖

圖6 超聲功率比對金銀花總黃酮得率的影響圖

圖4 提取溫度對金銀花總黃酮得率的影響圖

圖5 提取料液比對金銀花總黃酮得率的影響圖

經F檢驗，粉碎粒度對結果影響差異顯著（P＜0.05）。B是乙醇濃度對金銀花總黃酮得率的影響。經F檢驗，乙醇濃度對結果影響差異極顯著（P＜0.05）。C是提取時間對金銀花總黃酮得率的影響。經F檢驗，提取時間對結果影響極顯著（P＜0.05）。D是提取溫度對金銀花總黃酮得率的影響。經F檢驗，提取溫度對結果影響有一定的顯著性，但并不是很明顯。E是料液比對金銀花總黃酮得率的影響。經F檢驗，料液比對結果的影響極顯著（P＜0.05）。F是超聲功率對金銀花總黃酮得率的影響。經F檢驗，超聲功率對結果影響極顯著（P＜0.05）。經上單因素分析粉碎粒度、提取溫度對結果影響并沒有特別顯著，其余4個因素對結果有極顯著性影響，故選擇乙醇濃度、提取時間、料液比、超聲功率4個因素進行后續的響應面試驗設計。

2.2 超聲波輔助乙醇提取金銀花總黃酮最佳工藝的研究

2.2.1 BBD試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇乙醇濃度、提取時間、料液比和超聲功率4個對金銀花總黃酮得率影響顯著的因素，對其提取工藝參數進行后續的響應面優化，沒有顯著影響的因素選取為60目粉碎粒度，提取溫度保存70 ℃恒溫。響應面試驗水平因素如表1所示。

表1 響應面試驗水平因素表

2.2.2 試驗結果與分析

表2 響應面分析結果及指標預測表

續表2

2.2.3 數學模型建立及顯著性檢驗

采用ANOVA變異系數分析響應面試驗結果，其顯著性檢驗結果如表3所示，當Prob＞F值小于0.05時，該因素才具有顯著性。

采用Design-Expert處理軟件，構建影響因素與總黃酮得率（Y）之間數學關系，得到方程為：

從表3的結果可以看出，提取時間和超聲功率這兩個因素，其Prob＞F值小于0.01（均＜0.001），說明提取時間和超聲功率對黃酮提取的影響極為顯著，相反乙醇濃度、料液比所對應的Prob＞F值均大于0.05，表明這兩個影響不顯著，整體模型的“Prob＞F”值小于0.01，表明該擬合模型二次方程為極顯著；失擬項比F值為0.85，不顯著，說明試驗數據可靠，擬合二次方程模擬的比較好，可以比較準確地應用于總黃酮提取得率的預測；方程相關系數R2為0.9以上，預測值與真實值之間相關性較好，并且其校正決定系數也是0.9以上，表明充分考慮自變量情況下，該回歸方程擬合程度很高。

表3 顯著性檢驗結果表

2.2.4 總黃酮提取最佳工藝驗證試驗

利用上文擬合的數學模型進行最優工藝參數預測，可得：乙醇濃度為56.64%，提取時間為40.47 min，料液比為1∶40，超聲功率為150 W，此時金銀花總黃酮得率最大預測值為11.48%。采用預測的最優工藝參數進行試驗驗證，考慮實際操作方便性，將黃酮提取工藝參數調整為：乙醇濃度為57%，提取時間為40 min，料液比為1∶40，提取功率為150 W，結果得到金銀花總黃酮得率為11.41%，與模型預測值的誤差為0.61%，因此可知模型預測值與試驗值相近，金銀花總黃酮提取工藝參數準確可靠。

2.2.5 提取工藝響應面交互試驗影響效果

影響金銀花提取因素之間的交互作用對總黃酮得率的影響效果如圖7所示。

圖7 提取因素之間的交互作用對總黃酮得率的影響圖

圖a顯示的是在料液比為1∶40，超聲功率為150 W時，乙醇濃度、提取時間對總黃酮提取得率的交互影響。從圖可知，乙醇濃度、提取時間對總黃酮提取得率的交互影響情況相似，隨著乙醇濃度增加或提取時間的延長，總黃酮提取得率先上升后下降。

圖b所示為，當超聲功率150 W、提取40 min時，乙醇濃度和料液比對總黃酮提取得率的交互影響。由圖可知，當提取液乙醇濃度較低、料液比較小時，黃酮提取得率也較小，隨著乙醇濃度、料液比的增加，提取得率提高，但增大到一定程度后，得率會略有下降，原因可能是提取乙醇濃度過高時，金銀花中總黃酮的溶解度反而下降，而且超聲時間延長，可能導致黃酮破壞和降解。因此，當乙醇濃度為56.64%、料液比為1∶40時，最有利于金銀花總黃酮得率的增加。

圖c顯示的是在提取時間為40 min和料液比為1∶40時，乙醇濃度與超聲功率對金銀花總黃酮得率的影響。從中可以看出，響應值對乙醇濃度與提取功率的變化較不敏感，響應面的坡度較平。在試驗范圍內，金銀花總黃酮的提取得率隨著乙醇濃度、提取功率增大，而呈現出先增后降的趨勢。因此，在一定范圍內，增加乙醇濃度、超聲功率有利于總黃酮得率提升。當乙醇濃度為56.64%、提取功率為150 W、提取時間為40 min、料液比為1∶40時，金銀花總黃酮的得率最大。

圖d顯示的是在乙醇濃度55%為與超聲功率為150 W時，提取時間、料液比對總黃酮提取得率的交互影響。從圖可知，在一定范圍內，金銀花總黃酮得率隨著提取時間的延長而先增后減，隨著料液比的增加而先增后變化不明顯?？赡苁且驗殡S著提取時間延長，溶液黃酮可能被降解或者氧化，導致黃酮提取得率降低；料液比的增加，增大了物料與液體的接觸面積，加速了黃酮的溶出。因此，當乙醇濃度為56.64%、提取溫度為70 ℃、提取時間為40.47 min、料液比為1∶40時，金銀花總黃酮的提取得率最大。

圖e顯示的是在乙醇濃度為55%和料液比為1∶40時，提取時間、超聲功率對金銀花總黃酮提取得率的交互影響。由圖可知，金銀花總黃酮的得率隨著提取時間與提取溫度的增加而先增加后減少，可能是因為長時間的高溫會破壞黃酮結構或者促進其氧化轉變。乙醇濃度55%、料液比1∶40、提取功率150 W、提取時間40.47 min，此條件下金銀花總黃酮的提取得率達到最大。

圖f顯示的是在提取時間40.47 min、乙醇濃度55%時，料液比、超聲功率對金銀花總黃酮提取得率的交互影響。金銀花總黃酮的提取得率隨著料液比的增加而先增加后減少，隨著提取溫度上升提取得率先增加后緩慢下降。因此，當提取時間為40.47 min、乙醇濃度為55%、料液比為1∶40、超聲功率為150 W時，金銀花總黃酮的提取得率達到最大，最有利于黃酮的溶出。

4 結論

利用單因素試驗分析和響應面優化，并經試驗驗證得到金銀花中超聲輔助乙醇提取總黃酮的最優工藝為：57%乙醇提取濃度，提取時間40 min，料液比1∶40，150 W超聲功率，該工藝條件下，金銀花總黃酮提取得率為11.41%，黃酮提取得率比傳統提取方法有較為顯著的提高。本研究為藥食兩用原料金銀花中總黃酮高效提取和應用開發提供參考。