不同來源的巨噬細胞在小鼠腎臟纖維化中的作用*

姜亞麗，何 娟

(空軍軍醫大學第一附屬醫院腎臟內科，西安 710032)

全球13%～15%的成年人患有慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)，腎臟纖維化是慢性腎臟病進展至終末期腎病的共同病理過程，其主要病理改變是細胞外基質蛋白(膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白)的大量產生和堆積[1]。單側輸尿管結扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型是小管間質纖維化常見的實驗模型。腎纖維化是炎癥損傷修復過程，腎臟損傷的實質細胞會釋放一系列炎性介質、趨化因子，招募炎性細胞到腎間質，募集的炎性細胞和腎臟原位活化的免疫細胞共同參與腎纖維化的發生發展[2-3]，其中單核巨噬細胞浸潤是小管間質主要病變特征。

大量研究證實巨噬細胞可通過多種方式參與腎纖維化，由于巨噬細胞異質性及腎纖維化機制復雜性[4-5]，因而研究腎纖維化發病的細胞學和分子機制具有重要的臨床意義。以往的研究顯示，骨髓來源的炎性巨噬細胞及其增殖主要貢獻了腎纖維化形成[6]。而近年研究發現，腎臟組織定居型巨噬細胞也參與了腎臟纖維化的形成[7]。但腎臟組織定居型巨噬細胞和骨髓來源的炎性巨噬細胞在腎臟纖維化中究竟哪一個發揮主要作用，目前尚不清楚。本研究利用巨噬細胞CX3CR1GFP轉基因小鼠建立UUO模型，初步探討腎纖維化過程中不同來源巨噬細胞對腎纖維化的貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

CX3CR1GFP轉基因雄性C57/B6小鼠12只和未轉基因C57/B6小鼠6只(WT組，作為對照)，8～10周齡，體重20～25 g，由中國人民解放軍空軍軍醫大學實驗動物中心提供。飼養于無特定病原體(SPF)級環境，恒溫恒濕，24 h自由進食和飲水。

1.2 方法

1.2.1動物分組及UUO模型建立

12只8～10周齡大小的CX3CR1GFP轉基因雄性C57/B6小鼠分為兩組(每組6只)：Sham組和UUO組，其中UUO組又分為UUO(-)和UUO(+)，UUO組2周處死動物，留取結扎側腎臟作為UUO(+)組，對側腎臟作為UUO(-)組，同時Sham組在同一時間點處死，留取小鼠腎組織進行后續實驗；另外6只同樣周齡大小的WT組雄性C57/B6小鼠，不進行手術。

1.2.2UUO

5%的水合氯醛(10 μL/g)腹腔注射麻醉，選擇腹正中切口，依次切開皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，將左側輸尿管用組織鉗托起中段部位，止血鉗夾住，兩端用4-0絲線兩次結扎左側輸尿管靠近腎盂段，剪斷輸尿管，然后縫合肌肉和皮膚。

1.2.3腎組織病理學檢查

麻醉后，用PBS從左心室灌注沖走腎臟組織血液，一部分腎組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片，用于Masson染色和蘇木素-伊紅(HE)染色，分別評價膠原纖維沉積及間質炎性細胞浸潤。Masson染色：用帶顯微裝置的數字照相機掃描膠原纖維染色區域，并通過NIS-Elements Br 3.0 軟件行半定量分析，膠原纖維沉積程度以膠原染色面積占總面積的百分比表示。HE染色：定量統計每高倍鏡下間質炎性細胞數量。

1.2.4免疫熒光染色

腎組織用4%多聚甲醛固定，蔗糖脫水，OCT包埋后放入-80 ℃冰箱速凍，在低溫恒溫箱中冰凍切片(5 μm)，-80 ℃冰箱貯存。切片用丙酮在室溫下固定10 min，牛血清清蛋白(BSA)封閉。甩掉封閉液后，分別滴加抗KI67抗體和抗α-SMA抗體(美國eBioscience公司，1∶400，1∶200)，4 ℃封閉過夜，PBS沖洗3次，每次7～8 min。然后Hochest(1∶10 000)染核，50%甘油封片，熒光顯微鏡觀察并照相。每張切片選5個視野，計數CX3CR1GFP+KI67+雙陽性細胞占CX3CR1GFP陽性細胞的百分比及α-SMA陽性細胞數。

1.2.5實時熒光定量 PCR(RT-qPCR)

TGF-β和Col-1引物設計與合成由日本TaKaRa公司完成。反應體系為20 μL，其中SYBR mix 10 μL、熒光定量PCR參比染料 (×50 ) 0.4 μL、上下游引物各為 0.5 μL、cDNA模板1.0 μL、ddH2O 7．6 μL。反應條件：預變性 95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 34 s，72 ℃，45個循環。每1個樣本設3個復孔，以β-actin為內參照。 實驗數據用 ABI 7500 自帶軟件進行分析。

1.2.6腎臟單細胞懸液的流式細胞術

采用1.2.4方法獲取腎臟組織。制備腎臟細胞：取一小部分腎組織稱重，充分研磨，37 ℃搖床上用膠原酶Ⅳ(2 mg/mL)消化30 min，尼龍膜過濾，4 ℃離心機1 200 r/min離心4 min，棄上清液，加入紅細胞裂解液重懸細胞，靜置5 min，流式液終止裂紅，1 200 r/min離心4 min，洗滌2次。腎臟細胞密度大，加流式液5 mL重懸，冰上靜置30 min，吸取上層2/3上清液，1 200 r/min離心4 min，重懸獲得單細胞懸液，顯微鏡下計數。平均每管6×105個細胞，加入10 μL 10%大鼠血清，4 ℃封閉10 min，加APC-ly6c抗體(1∶50稀釋)、PE-F4/80抗體(1∶100稀釋)；APC-CD11B抗體(1∶100稀釋)、APC-CD11B(1∶100稀釋)、PE-CCR2(1∶100稀釋)，4 ℃孵育25 min。加入2 mL流式液重懸清洗細胞，4 ℃離心機1 200 r/min離心4 min。將碘化丙啶(PI)用流式液稀釋(1∶1 000)，每管以300～400 μL PI稀釋液重懸細胞，上機分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 UUO導致腎臟纖維化和炎性細胞浸潤

轉基因小鼠CX3CR1GFP鑒定：流式細胞術檢測發現轉基因小鼠出現CX3CR1GFP+F4/80+雙陽性巨噬細胞，而WT組僅有F4/80+陽性巨噬細胞出現，見圖1。Masson染色結果提示：與WT組、UUO(-)組和Sham組比較，UUO(+)組小鼠腎組織膠原纖維沉積增多，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且WT組、Sham組與UUO(-)組比較差異無統計學意義(P>0.05)。HE染色結果顯示:UUO(+)組間質炎性巨噬細胞浸潤明顯多于WT組、Sham組和UUO(-)組，且差異有統計學意義(P<0.01)，且WT組、Sham組與UUO(-)組比較差異無統計學意義(P>0.05)。α-SAM免疫熒光染色結果提示：與WT組、UUO(-)組和Sham組比較，UUO(+)組小鼠腎組織α-SMA陽性細胞數明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)，且WT組、Sham組與UUO(-)組比較差異無統計學意義(P>0.05)。進一步通過RT-qPCR實驗發現，UUO(+)組腎組織TGF-β、Col-1 mRNA相對表達水平明顯高于WT組、Sham組和UUO(-)組，且差異有統計學意義(P<0.05)，而WT組與Sham組、UUO(-)組3組間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 流式細胞術結果顯示轉基因小鼠CX3CR1GFP+F4/80+雙陽性巨噬細胞明顯高于WT小鼠

A：Masson、HE、α-SMA免疫熒光染色(40×)及定量分析；B：RT-qPCR定量分析；a:P<0.05,b:P<0.01。

2.2 UUO后腎臟組織定居型巨噬細胞和骨髓來源巨噬細胞明顯增加

上述結果已證實WT組與Sham組在組織學和炎性細胞方面無差異，接下來將不闡述WT組結果。流式細胞術結果顯示，與Sham和UUO(-)組比較，UUO(+)組ly6c-F4/80+CX3CR1GFP+細胞數明顯增多。結果還顯示3組間ly6c+F4/80+CX3CR1GFP+細胞幾乎為0(提示ly6c+細胞與募集炎性細胞有關)，見圖3A；進一步通過流式細胞術分析組織定居型巨噬細胞，發現UUO(+)組中CD11B+F4/80+CX3CR1GFP+細胞(組織定居型巨噬細胞)明顯高于Sham組和UUO(-)組，差異有統計學意義(P<0.05)，且Sham組與UUO(-)組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果還顯示UUO(+)組中CD11B+F4/80+CCR2+細胞(骨髓來源的炎性巨噬細胞)同樣高于Sham組和UUO(-)組，差異有統計學意義(P<0.05),見圖3B。但CD11B+F4/80+CX3CR1GFP+細胞增加數量明顯多于CD11B+F4/80+CCR2+細胞，說明腎間質中組織定居型巨噬細胞和骨髓來源的炎性巨噬細胞均參與腎纖維化進展，前者貢獻可能更突出。

A：UUO后，腎間質中組織定居型巨噬細胞(ly6c-F4/80+CX3CR1GFP+)浸潤明顯增多；B：UUO后，腎組織中骨髓來源炎性巨噬細胞(CD11B+CX3CR1GFP+CCR2+)浸潤明顯增多。a：P<0.05。

2.3 纖維化腎組織定居型巨噬細胞增殖明顯增加

與Sham組和UUO(-)組比較，UUO(+)組小鼠腎組織CX3CR1GFP+及CX3CR1GFP+KI67+的細胞明顯增多，且差異有統計學意義(P<0.01)。Sham組和UUO(-)組比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示組織定居型巨噬細胞及其增殖在腎纖維化中發揮重要作用。見圖4。

a:P<0.01。

3 討 論

大量研究已經證實巨噬細胞與腎纖維化密切相關。由于巨噬細胞具有高度可塑性、局部組織功能特異性、炎癥因子誘導下分化異常等特點，使其在腎纖維化過程中具有促纖維化形成及促纖維化降解的雙重作用[8-10]。以往研究已證實，骨髓來源的炎性巨噬細胞在腎臟纖維化的發生發展中起重要作用[6]。而近年研究發現，腎臟定居型巨噬細胞也參與了腎臟纖維化的形成[7,11-12]。

在各種腎臟損傷模型中，CX3CR1介導的巨噬細胞浸潤在腎纖維化中發揮重要作用，而且是第1個被證實的趨化因子受體貢獻了腎纖維化的形成[13-14]。而最近的一項研究顯示，敲除CX3CR1基因的巨噬細胞腎臟纖維化加重，提示CX3CR1+巨噬細胞對腎臟纖維化具有保護作用[15]。可見腎臟CX3CR1+巨噬細胞對腎纖維化作用仍存在爭議，值得進一步研究。本研究使用CX3CR1GFP轉基因小鼠建立UUO模型，結果顯示UUO后UUO(+)組腎臟中組織定居型巨噬細胞(CD11B+F4/80+CX3CR1GFP+)和骨髓來源的炎性巨噬細胞(CD11B+F4/80+CCR2+)浸潤均增加，且前者明顯多于后者，因此筆者推測組織定居型巨噬細胞在腎臟纖維中可能發揮主要作用。

本研究還發現，UUO(+)組腎臟中CX3CR1GFP+巨噬細胞明顯高于UUO(-)組和Sham組，因此筆者猜想，CX3CR1GFP+巨噬細胞在UUO過程中是否發生了增殖或表型轉化？于是筆者又通過增殖實驗進一步探討CX3CR1+巨噬細胞的增殖對腎臟纖維化產生的影響。結果顯示，UUO(+)組腎臟中CX3CR1GFP+巨噬細胞的增殖明顯高于UUO(-)組和Sham組，提示組織定居型巨噬細胞的增殖參與了腎纖維化過程。且已有研究顯示在UUO誘導的腎纖維化模型中，藥理性抑制ERK可以減少腎間質巨噬細胞的增殖，但巨噬細胞增殖的減少并沒有造成腎纖維化的減輕[16]。由此可見，腎臟定居型巨噬細胞的增殖在腎纖維化中發揮重要作用。

本研究顯示，UUO過程中腎間質中組織定居型巨噬細胞和炎性巨噬細胞浸潤均增多，且以前者為主，進一步通過增殖實驗證明組織定居型巨噬細胞增殖在腎纖維化過程中發揮重要作用。但是否骨髓來源的炎性巨噬細胞發生表型轉化貢獻了組織定居型巨噬細胞，需進一步研究證實。