雙酚A暴露誘導雌性大鼠性早熟的下丘腦KISS-1和GPR54基因甲基化分子機制探討*

羅小娟，曹 科△，陶明俊，陳小文，張 琴，彭 剛，陳運生

(廣東省深圳市兒童醫院：1.檢驗科;2.兒研所;3.內分泌科;4.青春期婦科 518038)

雙酚A(BPA)作為一種環氧樹脂和聚碳酸酯塑料的重要化工原料，廣泛存在于人類日常生活用品和生存環境中，并可通過消化道、呼吸道和皮膚等途徑暴露于人類，引發公共健康和安全問題[1-3]。近年來，女童性早熟發病率存在明顯上升趨勢，隨著人體血液、尿液等生物標本BPA的檢出，其對雌性個體青春發育和內分泌的干擾作用及對生殖系統的毒性機制，引起公眾和學術界的廣泛關注。有研究認為BPA通過擬雌激素樣作用，干擾人類內分泌系統的平衡和生殖系統的正常發育和功能，可能與女童特發性中樞性性早熟(ICPP)的發生、發展有關[4-6]，但其確切的致病機制尚未闡明。青春期啟動與發育是遺傳基因與環境因素共同作用的結果，新近研究認為 BPA暴露可能通過干擾和改變DNA甲基化等基因表觀遺傳學方式影響生殖系統的正常發育和功能[7-10]。下丘腦KISS-1/GPR54基因對促性腺軸的啟動至關重要，KISS-1基因編碼蛋白kisspeptin通過與受體蛋白GPR54結合，可刺激GnRH釋放而啟動下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)，且其促性腺激素效應的基本位點在下丘腦GnRH神經元內，且是唯一通過GPR54介導的表達來實現。目前，國內外先后運用各種最新技術手段對KISS-1/GPR54基因變異和多態性進行檢測分析，結果表明KISS-1/GPR54基因變異和多態性并不是導致性早熟的常見原因，提示可能存在環境因素通過表觀遺傳學機制上調KISS-1/GPR54基因的表達，進而刺激GnRH釋放啟動HPGA導致性早熟。

本研究采用動物模型以處于青春啟動前關鍵期的雌性幼鼠(出生21 d)作為研究對象，通過灌胃給予BPA染毒干預，以17β-雌二醇(E2)組作為陽性對照，同時設立溶劑對照組，通過觀察大鼠陰道開口時間(vaginal opening day,VOD，雌性大鼠性早熟的標志)，檢測大鼠卵巢ERα、ERβ mRNA和下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA表達和基因甲基化水平。探討BPA暴露誘導雌性大鼠性早熟的DNA甲基化分子機制，對降低人類BPA暴露危害和女童性早熟等疾病的防治提供科學依據和參考價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

BPA(分析純99%)，美國Sigma公司，玉米油(溶劑)購于益海嘉里投資有限公司，核酸分離純化試劑盒購于廣州洪祥生物醫藥科技有限公司，熒光定量PCR反應試劑盒購于日本TaKaRa公司，ERα、ERβ、KISS-1、GPR54引物由上海 Invitrogen 公司合成，DNA Methylation-Gold 試劑盒購于美國ZYMO公司，其他生化試劑及耗材等均購于上海生工生物工程股份有限公司。儀器：Localized Performance超低溫冰箱購于美國Thermo Fisher公司，Eppendorf 5418低溫高速離心機購于德國Eppendorf公司，Millipore-Q A10 超純水儀購于美國Millipore 公司，可見紫外分光光度計購于日本島津公司，PyroMark Q24 焦磷酸測序儀購于美國Qiagen公司，ABI 7900 HT 熒光定量PCR儀購于美國Life Tech公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物模型的建立

經檢疫合格的清潔級1 d齡SD大鼠購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物質量合格證明編號：44007200025061，無特定病原體(SPF)級動物房飼養，飼養室溫度、濕度等條件保持穩定，12 h光照和黑暗循環、自由進食飲水，整個實驗過程均喂以不含大豆異黃酮等植物雌激素的加工飼料，仔鼠于21 d齡斷乳稱重，留取32只雌性幼鼠，分成4組：BPA干預組、BPA空白對照組(以等體積不含BPA的玉米油灌胃處理，并與BPA干預組同時處死)、E2組(17β-estradiol組，E2組，0.1 mg/kg)和溶劑對照組(以等體積不含BPA的玉米油灌胃處理直至大鼠出現陰道開口再處死)，以大鼠皮膚染色和籠具雙重編號標記識別。根據既往研究報道[11-12]，BPA干預濃度設為每天0.25 mg/kg，在人群日常暴露范圍內，每天以灌胃方式持續給藥10 d，溶劑對照組以相同方式給予等量玉米油。每4天稱重1次，依據體重調整藥物劑量。每天檢查并記錄大鼠陰道開口，并于陰道開口當天處死，處死BPA干預組時按等比例處死BPA空白對照組。留取大鼠下丘腦和卵巢組織置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測。本研究由廣東省醫學實驗動物中心批準，符合動物倫理原則，將實驗大鼠傷害降至最低，無虐待動物行為。

1.2.2卵巢ERα、ERβ mRNA和下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA表達水平檢測

分別取出30 mg下丘腦和卵巢組織加入1 mL TRIzol充分研磨，按照RNA提取試劑盒說明書提取下丘腦和卵巢組織總RNA，經紫外光分光光度計檢測核酸純度，將RNA 逆轉錄成cDNA。根據SYBRGreen Real-Time PCR Master Mix試劑盒說明，對下丘腦KISS-1、GPR54和卵巢ERα、ERβ目的基因和管家基因GAPDH分別進行實時PCR(real-time PCR)，real-time PCR反應體系： PCR Master Mix 10 μL,正反向引物各1 μL,去離子水6 μL,cDNA 2 μL,共20 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 30 s，共50個循環。72 ℃收集熒光，并行基因表達水平分析。各基因引物序列見表1。

表1 目的基因和管家基因引物序列

1.2.3卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54啟動子區甲基化水平測定

分別取卵巢和下丘腦組織經充分研磨，按照DNA提取試劑盒說明書分離純化核酸,將提取的DNA置于-20 ℃冰箱內保存備用。亞硫酸氫鹽轉化和焦磷酸測序PCR：基因組DNA 經過亞硫酸氫鹽處理，序列中未甲基化的胞嘧啶(C)轉變為尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不變。采用CPGPLOT軟件預測目的基因CpG島區域，針對上述基因CpG島設計合成特異性引物擴增目的區段，按儀器和試劑說明書進行單鏈的分離純化和焦磷酸測序。測定目標位點中C/胸腺嘧啶(T)的比率，以此判斷目標位點的甲基化程度。目的基因CpG位點甲基化水平(%)=mC/(mC+T),其中mC表示處于甲基化狀態的CpG位點測序序列條數，T表示處于非甲基化狀態的CpG位點測序序列條數。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠VOD和體重比較

BPA干預組和E2組VOD比溶劑對照組顯著提前(P<0.05)，E2組較BPA干預組更早(P<0.05)；第1次給藥前各組大鼠體重相當(P>0.05)，處死時BPA干預組、BPA空白對照組和E2組體重顯著低于溶劑對照組(與生存天數相關，P<0.05)，BPA干預組和BPA空白對照組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠VOD和體重比較

2.2 各組大鼠卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54基因mRNA表達情況比較

BPA干預組下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA相對表達水平顯著高于BPA空白對照組(P<0.05)，但與溶劑對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。E2組卵巢ERβ和下丘腦KISS-1 mRNA相對表達水平明顯低于溶劑對照組(P<0.05)。E2組和溶劑對照組下丘腦GPR54 mRNA相對表達水平顯著高于BPA空白對照組(處死時尚未出現VOD，P<0.05。見表3。

表3 各組大鼠卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54基因mRNA相對表達水平比較

2.3 各組大鼠卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54基因CpG 位點甲基化水平比較

BPA干預組、BPA空白對照組、E2組和溶劑對照組4組間比較，下丘腦KISS-1基因CpG 位點甲基化水平差異無統計學意義(P>0.05)，而GPR54基因CpG 位點甲基化水平存在明顯差異，其中BPA干預組、E2組和溶劑對照組GPR54片段1 CpG 位點甲基化水平顯著低于BPA空白對照組(處死時尚未出現VOD，P<0.05)。BPA干預組GPR54片段2 CpG 位點甲基化水平顯著低于溶劑對照組，而E2組卵巢ERβ基因CpG位點甲基化水平顯著高于溶劑對照組(P<0.05)，其余未見統計學差異。見表4。

表4 各組大鼠卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54基因CpG 位點甲基化水平比較[M(P25,P75)，%，n=8]

2.4 VOD與各目的基因CpG位點甲基化水平的相關性

經秩相關分析，大鼠VOD與GPR54片段1 CpG位點甲基化水平之間呈正相關(r=0.245,P=0.009)，其余目的基因CpG位點甲基化水平與VOD之間未見明顯相關(P>0.05)，見表5。

表5 VOD與各目的基因CpG位點甲基化水平的相關性

3 討 論

個體的生長發育和性成熟過程受基因、環境、營養和社會因素等影響[13-14]，近年來，環境內分泌干擾物(environmental endocrine disrupting chemicals,EDCs)對生殖健康和內分泌干擾作用備受關注。BPA是世界上最高產量的有機化工原料之一，是一種常見且有代表性的EDCs，具有類雌激素樣內分泌干擾作用和生殖毒性。本研究采用玉米油為溶媒，BPA空白對照組采用和BPA干預組等體積的溶媒灌胃處理，同時設立溶劑對照組，旨在最大限度地減少溶媒對實驗結果的影響，保證結論的可信性。研究結果顯示，BPA干預染毒可致處于青春啟動前關鍵期的雌性幼鼠VOD提前，與國內外研究結果一致[11,15-17]，提示青春期前BPA暴露可促進青春期發育，導致雌性幼鼠性早熟。但是BPA引起性早熟的劑量效應關系有待進一步研究分析。據文獻報道，EDCs存在“U”效應現象，即在一定的劑量范圍內，劑量-效應曲線的斜率可發生正負轉換[18]。

近年來，隨著表觀遺傳學機制研究的顯著進展，DNA甲基化分子機制在“青春發育啟動”這個兼有短期快速和長期緩慢調節特點的復雜生理現象中的調控作用備受關注[19-20]。EDCs等環境因素直接改變靶基因序列并不常見，而是主要通過改變靶基因啟動子區DNA甲基化、組蛋白修飾和微RNA(micro RNA)介導等表觀遺傳學機制調控其轉錄和表達，啟動子區DNA高甲基化能抑制轉錄因子與其結合，導致基因表達抑制或沉默，從而發揮其毒性和干擾作用。動物研究表明，GnRH、ESR1等HPGA相關基因啟動子區甲基化水平改變可能導致青春發育啟動時間提前[21]；新生小鼠BPA暴露可能通過改變細胞信號通路重要基因甲基化水平，導致成年后前列腺癌的患病風險增加；BPA暴露水平與不孕癥婦女外周血DNA甲基化水平相關[22]。動物和人體研究均表明下丘腦KISS-1/GPR54基因系統是HPGA激活和青春期啟動的關鍵環節，是GnRH神經元和HPGA的重要調控基因。本研究結果顯示，GPR54 mRNA表達和基因片段1 CpG位點甲基化水平在大鼠VOD出現與否組別間存在顯著差異，即進入青春期大鼠下丘腦GPR54 mRNA表達和基因片段1 CpG位點甲基化水平較青春期前發生顯著改變。且其甲基化水平與大鼠VOD之間存在正相關，推測GPR54基因片段1 CpG甲基化改變與大鼠青春期啟動有關。另外，BPA干預組GPR54片段2 CpG甲基化水平顯著低于溶劑對照組，且其 mRNA表達水平顯著高于BPA空白對照組，提示GPR54片段2 CpG位點甲基化水平降低和mRNA表達增加，可能是BPA暴露誘導雌性大鼠性早熟的表觀遺傳調控機制之一。

本研究發現，BPA干預組KISS-1 mRNA表達水平顯著高于空白對照組，但KISS-1基因CpG位點甲基化水平在4組(BPA干預組、BPA空白對照、E2組和溶劑對照組)間差異并無統計學意義(P>0.05)，這可能與KISS-1基因上游調控因子的轉錄抑制有關。LOMNICZI等[23]對雌鼠青春發育啟動機制研究結果證實，大鼠下丘腦PcG蛋白是KISS-1基因的轉錄抑制因子和主要抑制蛋白。大鼠在青春期啟動關鍵期，下丘腦PcG蛋白關鍵基因甲基化增強導致PcG蛋白表達下降，對KISS-1基因的轉錄抑制減少，引起KISS-1基因表達增強從而激活青春期的啟動。如果PcG蛋白關鍵基因啟動子的甲基化被抑制，大鼠則無法進入青春期發育。因此，推測BPA可能通過DNA甲基化機制作用于大鼠下丘腦PcG蛋白關鍵基因啟動子區CpG位點，導致PcG蛋白關鍵基因抑制或沉默，繼而PcG蛋白阻斷轉錄活化因子與KISS-1基因啟動子區結合的功能下調，PcG蛋白抑制KISS-1基因轉錄作用減弱，從而使得KISS-1基因轉錄增強。也即，BPA暴露誘導雌性大鼠性早熟的表觀遺傳學機制，并不是直接通過改變KISS-1基因CpG位點甲基化實現，提示青春期啟動涉及興奮和抑制雙向有序調節的多基因功能網絡系統，其明確機制有待進一步實驗研究和驗證。

本研究將E2干預組作為大鼠VOD提前的陽性對照[24]。結果顯示，E2組VOD提前較BPA干預組更早，E2干預組大鼠卵巢ERβ基因mRNA表達和CpG位點甲基化水平均與溶劑對照組間存在顯著差異，且E2下丘腦KISS-1 mRNA表達水平明顯低于溶劑對照組。表明E2暴露可通過改變ERβ基因CpG位點甲基化水平，從而下調卵巢ERβ基因mRNA表達水平。卵巢ERα作用以引起卵泡細胞增殖為主，而ERβ則是卵巢組織中雌激素發揮作用的重要受體和途徑[25]。推測雌性幼鼠給予高濃度E2干預，一方面可通過ERβ基因CpG位點甲基化機制下調ERβ表達水平，另一方面可能導致下丘腦 KISS-1 基因神經元應對性激素正反饋通路破壞導致KISS-1 mRNA表達水平下降，最終干擾和破壞HPGA的正常功能。

綜上所述，本研究初步探討了BPA暴露誘導雌性大鼠性早熟的下丘腦KISS-1和GPR54基因甲基化分子機制，提示下丘腦GPR54基因甲基化水平改變可能是BPA生殖毒性機制之一。筆者期待DNA甲基化和組蛋白修飾結合特定細胞群分離術等先進技術，以表觀遺傳學發病機制為突破口，揭示BPA等內分泌干擾素與內分泌疾病和性發育異常的關系，以指導人類更好地應對內分泌干擾素暴露和相關疾病的防治。