黃花蒿乙醇提取物對脂多糖誘導損傷奶牛乳腺細胞中乳蛋白合成的影響

胡 耀 宋 潔,2* 王麗芳 敖長金**

(1.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區高校動物營養與飼料科學重點實驗室，呼和浩特 010018；2.農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室(呼和浩特)，內蒙古自治區農牧業科學院，呼和浩特 010031)

奶牛乳房炎發病率高，治療成本昂貴，給全球奶牛養殖業造成了巨大的經濟損失。乳房炎主要由細菌侵入奶牛乳腺所致。本課題組前期采集我國內蒙古、黑龍江、山東、上海、河北5個奶業主產省區的患乳房炎奶牛乳樣，對引起乳房炎的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、克雷伯氏菌及無乳鏈球菌等病原微生物進行了分離鑒定和耐藥性評估，發現大腸桿菌分離率最高[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是大腸桿菌細胞壁上的主要毒力因子，當乳腺內發生大腸桿菌感染時，進入乳腺的細菌釋放出LPS，損傷奶牛乳腺細胞，導致奶牛乳脂率、乳蛋白率等顯著降低，產奶量大幅度減少甚至停產。抗生素是目前治療奶牛乳房炎最有效的手段，但其殘留性和毒副作用對人體健康危害極大，在全球范圍內被逐漸禁用[2-3]。近年來眾多研究表明，蒿屬植物在替代抗生素方面有顯著效果，黑沙蒿、艾蒿、豬毛蒿、褐苞蒿等蒿屬植物富含萜類、黃酮類、多糖類、精油、生物堿等生物活性物質，能通過增強機體免疫水平、修復組織氧化損傷、調控細胞炎癥因子、抑制病原菌活性等途徑發揮抗炎、抗氧化和殺菌等生物學作用[4-7]。黃花蒿不僅具有顯著的抗炎抗氧化作用，同時，其有效成分青蒿素是目前最具療效的抗瘧藥物成分之一。本課題組前期研究表明，黃花蒿乙醇提取物(ethanol extract ofArtemisiaannua，AAE)能改善奶牛乳成分。在奶牛飼糧中添加AAE能顯著上調奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)中硬脂酰輔酶去飽和酶(SCD)、脂肪酸合成酶(FASN)等乳脂合成相關基因的表達量，從而調控乳中乳脂合成以及共軛亞油酸含量[8-9]。

牛乳蛋白主要成分為酪蛋白和乳清蛋白，酪蛋白是衡量牛奶品質的一項重要指標，對人體極具營養價值。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和Juns激酶(JAK)-信號轉導轉錄激活因子(STAT)信號通路可通過介導BMECs增殖、分化、促乳因子分泌，從而調控乳蛋白合成[10-12]。前人研究發現，LPS不僅能顯著降低BMECs增殖水平和乳蛋白分泌功能，還能明顯抑制BMECs中mTOR、核糖體S6蛋白激酶1(S6K1)、真核起始因子4E(EIF4E)及真核細胞翻譯啟動因子4E結合蛋白1(EIF4EBP1)的基因表達量和磷酸化水平，這表明LPS可能通過抑制mTOR和JAK-STAT活化，從而降低乳蛋白率[13-14]。有研究發現，苜蓿素一定程度上能緩解LPS對乳腺細胞的氧化損傷以及乳蛋白合成的抑制作用[15]。但目前關于AAE對奶牛LPS誘導損傷乳腺細胞乳蛋白合成影響的研究未見報道。鑒于此，本文通過BMECs體外培養技術，研究AAE對LPS誘導損傷BMECs活力以及乳蛋白合成相關基因表達的影響，旨在對AAE調控大腸桿菌引起的奶牛乳房炎乳蛋白合成機制進行探討，為生產上改善乳房炎奶牛乳品質提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 試驗材料

試驗當日采集體況健康的奶牛乳腺組織，盡快帶回實驗室。AAE活性成分參見王麗芳等[8]。

1.1.2 主要試劑

脂多糖、膠原酶Ⅱ、胎牛血清、0.25%胰酶細胞消化液、DMEM/F-12(1∶1)培養基、青鏈霉素、胰島素轉鐵蛋白硒鈉購自美國Gibco公司；表皮生長因子(EGF)、氫化可得松、兩性霉素B、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；總RNA提取試劑購自天根生化科技(北京)有限公司；戊二醛、無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷購自國藥化學試劑有限公司。

1.2 試驗設計

試驗分為5組，對照組：BMECs用基礎培養基常規培養15 h；模型組：BMECs用基礎培養基常規培養3 h+10 μg/mL LPS處理12 h；AAE+LPS組：BMECs分別用含3、6、12 μg/mL AAE的基礎培養基培養3 h+10 μg/mL LPS處理12 h。

1.3 試驗方法

1.3.1 BMECs體外正常模型的構建

BMECs原代培養、純化和傳代等步驟參見丹妮[16]。選用3～4代細胞進行試驗。通過免疫熒光技術，對BMECs進行角蛋白-18免疫熒光鑒定，并繪制BMECs生長曲線。

1.3.2 細胞活力檢測

細胞活力采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法進行檢測，BMECs培養方法同1.2.1。第3代細胞復蘇后用胰酶細胞消化液消化下來，以9×104個/mL的細胞密度接入96孔板中，放入37 ℃二氧化碳恒溫培養箱中培養48 h。對照組：BMECs用基礎培養基常規培養15 h；模型組：BMECs用基礎培養基常規培養3 h，3 h后取出96孔板，吸取并棄掉上清液，每孔加入10 μg/mL LPS置于37 ℃二氧化碳恒溫培養箱中12 h；3個AAE+LPS組：BMECs分別用含有3、6、12 μg/mL AAE的基礎培養基培養3 h，3 h后取出96孔板，吸取并棄掉上清液，每孔加入10 μg/mL LPS置于37 ℃二氧化碳恒溫培養箱中12 h。

培養結束前4 h，取出所有96孔板，每孔加入20 μL MTT溶液，然后4 h后再次取出96孔板，棄去上清并每孔加入100 μL DMSO，振蕩培養10 min后使用全自動酶標儀檢測490 nm處吸光值。以此初步篩選適宜的AAE添加濃度。

1.3.3 乳蛋白合成相關指標檢測

將第3代BMECs接種到六孔板。試驗分組同1.2.2。待細胞融合度達到80%以上，采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒檢測β-酪蛋白、αs1-酪蛋白和總蛋白含量的測定。檢測方法參照ELISA試劑盒說明書，試劑盒購自泉州市睿信生物科技有限公司。

1.3.4 乳蛋白合成相關基因表達量的測定

將第3代BMECs接種到六孔板。試驗分組同1.2.2。待細胞融合度達到80%以上，去除上清后每孔分別加入1 mL的Trizol，具體方法參見石惠宇[17]的報道，進行總RNA的提取和質檢，然后使用第一鏈合成試劑盒(FastQuant RT Kit FastQuant cDNA)進行RNA反轉錄。參照彩色熒光定量預混試劑盒說明進行基因熒光定量，使用LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀，反應程序為；95.0 ℃預變性30 s；進行40個循環反應，95.0 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72.0 ℃延伸20 s。使用2-ΔΔCt法計算乳蛋白合成相關基因表達量。

表1 引物序列及參數Table 1 Primer sequences and parameters

1.4 數據分析

試驗數據先使用Excel 2016進行初步整理，然后使用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 BMECs生長情況和鑒定

如圖1所示，純化傳代至第3代的BMECs在2～8 d細胞活力呈線性增長，8 d以后細胞活力緩慢降低，這表明了傳代細胞具備正常增殖能力，但細胞培養應保持在8 d以內。如圖2所示，圖中紅色和藍色熒光部分分別表示角蛋白-18和細胞核，其中，角蛋白-18激發的紅色熒光清晰明亮，表明角蛋白-18在細胞核中表達量較大。證明已成功分離培養得到BMECs。

圖1 細胞生長曲線Fig.1 Cell growth curve

圖2 鑒定BMECs骨架蛋白CK-18 Fig.2 Identification of BMECs skeleton protein CK-18 (100×)

2.2 AAE對LPS誘導損傷BMECs活力的影響

由表2可見，與對照組相比，模型組的BMECs活力顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，3 μg/mL AAE提高了LPS誘導損傷BMECs活力，但差異不顯著(P>0.05)；6和12 μg/mL AAE顯著提高了LPS誘導損傷BMECs活力(P<0.05)。

表2 AAE對LPS誘導損傷BMECs活力的影響Table 2 Effects of AAE on viability of injured BMECs induced by LPS

2.3 AAE對LPS誘導損傷BMECs中乳蛋白含量的影響

如圖3所示，與模型組相比，12 μg/mL AAE組總蛋白含量顯著增高(P<0.05)；3和6 μg/mL AAE組總蛋白含量有所增加，但差異不顯著(P>0.05)。

數據柱標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

如圖4所示，6、12 μg/mL AAE組β-酪蛋白含量顯著高于模型組(P<0.05)，且與對照組無顯著差異(P>0.05)；3 μg/mL AAE組β-酪蛋白含量與模型組無顯著差異(P>0.05)，且顯著低于對照組(P<0.05)。

圖4 AAE對LPS誘導損傷BMECs中β-酪蛋白含量的影響Fig.4 Effects of AAE on β-casein content ofinjured BMECs induced by LPS

如圖5所示，3、6、12 μg/mL AAE組αs1-酪蛋白含量均顯著高于模型組(P<0.05)。

圖5 AAE對LPS誘導損傷BMECs中αs1-酪蛋白含量的影響Fig.5 Effects of AAE on αs1-casein content of injured BMECs induced by LPS

2.4 AAE對LPS誘導損傷BMECs中乳蛋白合成基因表達的影響

由表2可見，與模型組相比，12 μg/mL AAE顯著增加了α-酪蛋白(CSN1S1)基因表達量(P<0.05)，3、6、12 μg/mL AAE顯著增加了β-酪蛋白(CSN2)、mTOR、STAT5、EIF4EBP1、S6K1、JAK2基因表達量(P<0.05)，6、12 μg/mL AAE顯著增加了EIF4E基因表達量(P<0.05)。

3 討 論

3.1 AAE對LPS誘導損傷BMECs活力的影響

奶牛乳房炎在全世界范圍內均有極高的發病率，奶牛感染會出現不同程度泌乳機能損傷和生產性能下降。大腸桿菌是一種最常見的誘發乳房炎的環境病原菌之一，而LPS是大腸桿菌細胞壁外膜中的內毒素，是主要的致病因子，能誘導多種細胞類型凋亡和炎癥，對BMECs的增殖有顯著的抑制作用。研究表明，LPS可抑制BMECs增殖水平，導致細胞凋亡和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)等多種炎癥因子的產生[18]。另外，其他研究顯示，隨著LPS劑量的增大，毒性作用也隨之增強，且炎癥反應水平也與LPS呈劑量依賴性[13]。本試驗研究結果表明，模型組細胞活力顯著低于對照組，這與上述報道結果一致。植物提取物能增強LPS誘導損傷BMECs的抗氧化作用，降低細胞炎癥水平，從而恢復炎癥損傷細胞活力[19-20]。研究表明，AAE中的黃酮類和多糖類活性成分呈現出一定的抗炎活性，可下調細胞炎癥因子的mRNA和蛋白表達水平[21-22]。在本試驗中，AAE可提高LPS誘導損傷BMECs活力，這可能是AAE降低了LPS誘導的炎癥反應，但具體機制尚不清楚，需進一步研究。

3.2 AAE對LPS誘導損傷BMECs中乳蛋白含量的影響

牛乳中酪蛋白有αs1(40%)、β(36%)、αs2和κ 4種亞型，而每種亞型又因為翻譯后的磷酸化修飾和糖基化修飾而形成了多種基因變體[14]。研究表明，αs1-酪蛋白不僅可以促進動物體內鈣的沉積和鈣化以及其他礦物質元素的吸收，還可以改善動物機體免疫功能[23]。β-酪蛋白也能夠一定程度促進機體對鈣、鋅等礦物質的吸收，且β-酪蛋白在水解后會產生許多具有特殊生物學活性的物質，如免疫調節和抗氧化作用的生物活性肽[24]。LPS對酪蛋白合成有顯著的抑制作用，其可能通過下調氨基酸轉運水平從而導致酪蛋白分泌水平顯著降低[13]。植物提取物活性成分豐富，對乳腺炎奶牛及健康奶牛乳蛋白率有顯著的改善作用。宋潔等[25]在乳腺炎奶牛飼糧中添加以黃酮類、脂質類等為主要成分的復合植物提取物，結果顯示，該復合植物提取物能顯著提高乳腺炎奶牛的乳蛋白率。斯琴畢力格等[8]在體況相近的荷斯坦奶牛飼糧中添加AAE，結果顯示試驗組乳蛋白含量與對照組相比有增加趨勢[8]。本試驗中，10 μg/mL LPS顯著降低了BMECs中αs1-酪蛋白和β-酪蛋白含量，不同濃度的AAE能不同程度地提高LPS誘導損傷BMECs中總蛋白含量，6和12 μg/mL AAE顯著提高了LPS誘導損傷BMECs中β-酪蛋白含量，且3、6和12 μg/mL AAE時均能顯著提高LPS誘導損傷BMECs中αs1-酪蛋白含量。通過以上結果判斷，AAE可能通過提高受損傷BMECs中αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的含量來使細胞總蛋白含量恢復正常水平，且能一定程度上調節酪蛋白組成成分。

3.3 AAE對LPS誘導損傷BMECs中乳蛋白合成基因表達的影響

CSN2和CSN1S1作為酪蛋白的主要組成部分，受催乳素和糖皮質激素(HP)等促乳激素的調控，其基因表達量是衡量乳蛋白合成的重要指標[26-27]。牛乳蛋白合成主要由JAK-STAT5和mTOR/S6K1/EIF4 2個信號通路進行調控，mTOR信號通路是一個將營養供應、蛋白質合成和細胞生長結合起來的重要通路[28]。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在蛋白質合成過程中通過整合來自氨基酸、生長因子、能量狀態等營養物質的上游信號和壓力，在信號轉導中起重要作用[29]。mTOR信號通路一旦激活，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合靶點1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)開始磷酸化，并刺激下游蛋白S6K1和EIF4EBP1的表達，從而調控乳蛋白mRNA翻譯過程[12]。低磷酸化的4E結合蛋白(4E-bp1)與EIF4E結合，在mTORC1信號激活后，EIF4EBP1磷酸化與EIF4E分離[29-30]。催乳素和促生長因子可通過酪氨酸激酶Janus激酶(Janus kinase，Jak)使STAT5磷酸化。磷酸化的STAT5形成二聚體，進入細胞核與乳蛋白基因的啟動子和增強子結合，誘導其表達，從而促進乳蛋白合成。有研究表明，真核起始因子5(EIF5)受到STAT5的調控，同時STAT5活性與EIF5表達量呈正相關[31]。

LPS可激活細胞因子信號轉導抑制因子3(SOCS3)，活化后的SOCS3可抑制催乳素誘導的STAT5以及其下游蛋白的基因表達量[32]。較低濃度的LPS就能顯著下調JAK-STAT5和mTOR/S6K1/EIF4 2個信號通路相關基因的表達量[13]。研究表明，植物提取物可能通過促進乳蛋白合成相關信號通路基因轉錄及蛋白表達和磷酸化水平來改善LPS誘導損傷BMECs中乳蛋白合成水平降低現象。必需脂肪酸、維生素A、氨基酸等營養素都能不同程度地影響BMECs中乳蛋白CSN2和CSN1S1等相關基因的表達，其可能通過介導mTOR通路和JAK2-STAT5通路增加氨基酸的吸收利用和BMECs的增殖分化過程，從而調控乳蛋合成[33-35]。占今舜等[15]研究發現，苜蓿素能顯著上調LPS誘導損傷BMECs中mTOR、S6K1、JAK2、STAT5等乳蛋白合成相關通路基因的表達水平。

目前，有關AAE對LPS誘導損傷BMECs中乳蛋白合成及相關作用機制未見報道。本試驗研究結果表明，CSN1S1基因表達量隨AAE濃度增加呈劑量依賴性提高，高濃度AAE能顯著上調CSN1S1基因表達量。相對于模型組，3 μg/mL AAE即能顯著增加CSN2基因表達量，且與LPS誘導損傷BMECs中αs1-酪蛋白和β-酪蛋白含量變化趨勢相近。本試驗中，LPS誘導下調了乳蛋白合成信號通路相關基因表達量，與前人研究結果一致。與LPS誘導損傷的模型組相比，AAE能上調mTOR、S6K1、EIF4E、EIF4EBP1、JAK2和STAT5基因表達量，表明AAE可能通過提高mTOR及JAK2-STAT5信號通路基因表達來促進BMECs中乳蛋白合成。

4 結 論

① 10 μg/mL LPS可抑制BMECs活力和酪蛋白分泌，且能下調乳蛋白合成相關基因表達量。

② AAE可提高LPS誘導損傷BMECs活力。

③ AAE可提高LPS誘導損傷BMECs中總蛋白、β-酪蛋白和αs1-酪蛋白含量，以及BMECs中乳蛋白合成相關基因mTOR、S6K1、JAK2、STAT5、CSN1S1、CSN2、EIF4EBP1、EIF4E的基因表達量。

④ 12 μg/mL AAE對LPS誘導損傷BMECs中乳蛋白合成有較好的預保護效果。