不同剩余采食量的蛋鴨盲腸微生物組成及多樣性研究

楊 速 白 天 操勇清 黃學(xué)濤 陳斌丹 王武強(qiáng) 沈軍達(dá) 田 勇 李國(guó)勤 陶爭(zhēng)榮 陳 黎 趙阿勇 盧立志 曾 濤*

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；3.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，杭州 311300；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730000；5.諸暨市國(guó)偉禽業(yè)發(fā)展有限公司，紹興 311800；6.縉云縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，麗水 321400)

近年來(lái)，我國(guó)蛋鴨育種工作有些突破，但蛋鴨的飼料利用率相較于雞和肉鴨仍然較低，而飼料成本在現(xiàn)代家禽生產(chǎn)中約占總成本的70%[1]，因此研究有效提高蛋鴨飼料利用率的技術(shù)體系及其機(jī)制，對(duì)提升我國(guó)蛋鴨生產(chǎn)養(yǎng)殖水平和產(chǎn)業(yè)科技發(fā)展具有重要意義。Koch等[2]提出的剩余采食量(residual feed intake，RFI)是目前衡量家禽飼料利用率的理想選擇指標(biāo)。RFI指維持機(jī)體代謝過程和生產(chǎn)所需的期望采食量與實(shí)際采食量的差值[3]。研究表明，RFI能通過有效的個(gè)體選擇進(jìn)行改良[4-6]。Faure等[7]以RFI為選育指標(biāo)，經(jīng)過對(duì)大白豬6個(gè)世代的選育之后，平均日增重相同(760 g/d)，但低RFI組比高RFI組平均日采食量減少216 g/d，飼料轉(zhuǎn)化率提高11.7%。Bordas等[8]對(duì)產(chǎn)蛋雞的飼料利用率進(jìn)行了17代選育后發(fā)現(xiàn)，低RFI組的孵化率比高RFI組高30%。研究發(fā)現(xiàn)，選擇低RFI的番鴨飼養(yǎng)至7周齡可提高飼料利用率[9]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，蛋鴨RFI與采食量(FI)、飼料轉(zhuǎn)化率呈極顯著的正相關(guān)，表明在蛋鴨育種中選擇低RFI的蛋鴨能夠提高飼料利用率[10-11]。

腸道微生物與宿主的相互作用所構(gòu)成的腸道微生物系統(tǒng)越來(lái)越受到關(guān)注，腸道微生物對(duì)宿主的影響包括代謝、免疫和行為等[12-13]。其中，腸道微生物對(duì)家禽營(yíng)養(yǎng)吸收的影響是畜牧學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。家禽腸道較短，食糜排空快，但在盲腸中停留時(shí)間較長(zhǎng)，以供微生物發(fā)酵[14]。與其他腸段相比，家禽盲腸中微生物數(shù)量最多，產(chǎn)生的非淀粉多糖酶可將小腸無(wú)法消化吸收的非淀粉多糖發(fā)酵成短鏈脂肪酸，對(duì)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和提高飼料轉(zhuǎn)化率至關(guān)重要[15-16]。除了可以發(fā)酵飼料中難以消化的成分，某些腸道微生物也可以通過產(chǎn)生抗炎代謝物促進(jìn)腸道健康，保證腸道正常功能，從而提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[17]。對(duì)不同動(dòng)物的大量研究表明，腸道微生物與飼料利用率存在相關(guān)性。在豬方面，高飼料利用率的豬腸道微生物有更多利用食物中多糖和蛋白質(zhì)的能力，其可能通過發(fā)酵多糖產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)改善腸道健康，進(jìn)而提高豬的飼料利用率[18]。在反芻動(dòng)物方面，Guan等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高RFI和低RFI組牛瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異；腸道菌群中的琥珀酸菌屬、優(yōu)桿菌屬等與RFI相關(guān)，其可能的作用機(jī)理是通過參與VFA的合成與吸收，調(diào)節(jié)宿主的能量代謝，進(jìn)而影響機(jī)體RFI[20]。在家禽方面，不同飼料利用率肉雞在6個(gè)分類水平上優(yōu)勢(shì)菌群種類一致，但相對(duì)豐度存在差異[21]；不同產(chǎn)蛋率下肉雞腸道菌群存在差異，并進(jìn)而影響肉雞繁殖性能[22]；在產(chǎn)蛋雞上，盲腸微生物多樣性較十二指腸和糞便微生物多樣性高，對(duì)飼料利用率發(fā)揮著重要作用[23]。這些研究結(jié)果表明，畜禽RFI與腸道微生物群落多樣性及菌群組成、功能存在一定的聯(lián)系。因此，本研究旨在通過比較不同RFI蛋鴨個(gè)體的盲腸微生物組成，篩選候選差異菌群，為今后通過調(diào)控腸道菌群提高蛋鴨飼料利用率提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和基礎(chǔ)飼糧

試驗(yàn)選取400日齡的紹興鴨300只，由紹興市諸暨市國(guó)偉禽業(yè)紹興鴨國(guó)家級(jí)保種場(chǎng)提供。采用3層梯形式籠舍進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，每個(gè)籠位用隔板隔開，以避免因相互啄食飼料而造成試驗(yàn)誤差。基礎(chǔ)飼糧選用產(chǎn)蛋鴨高峰期顆粒狀配合飼料(蛋倍利)，購(gòu)自上海香川飼料有限公司。預(yù)試期10 d，正試期60 d(410～470日齡)，期間紀(jì)錄每個(gè)個(gè)體的采食量、平均蛋重(EML)、初始體重(IBW)、終末體重(FBW)，并計(jì)算每個(gè)個(gè)體的增重(GW)和代謝體重(BW0.75)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

1.2 RFI測(cè)定

RFI測(cè)定利用多元線性回歸方程計(jì)算個(gè)體RFI并排序，選取RFI最高和最低的各15只鴨，分別為高RFI組(HRFI組)和低RFI組(LRFI組)，屠宰后采集盲腸內(nèi)容物，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

RFI模型如下：

RFI=FI-(μ+a×BW0.75+b×GW+c×EML)[24]。

式中：FI為采食量；μ為截距；a、b、c為偏回歸系數(shù)；BW0.75為代謝體重；GW為增重；EML為平均蛋重。

1.3 腸道微生物檢測(cè)

使用德國(guó)QIAGEN公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini試劑盒提取盲腸微生物總DNA。經(jīng)DNA質(zhì)檢過后，HRFI組共提取到有效樣本13個(gè)，LRFI組共提取到有效樣本11個(gè)。以提取的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域選擇帶有barcode的特異引物，使用上游引物(F341：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和下游引物(R805：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)對(duì)細(xì)菌V3+V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將PCR擴(kuò)增所獲得的產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收，于-20 ℃保存。后續(xù)測(cè)序由浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司完成。本試驗(yàn)采用QIIME2(2019.4)、R語(yǔ)言等軟件對(duì)盲腸微生物進(jìn)行Alpha多樣性分析，采用主坐標(biāo)分析(PCoA)、主成分分析(PCA)和無(wú)度量定標(biāo)(MNDS)法進(jìn)行Beta多樣性分析，采用STAMP軟件分析組間差異菌群。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019和SPSS 22.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)和Wilcox秩和檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(mean±SE)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同RFI蛋鴨生產(chǎn)性能比較

由表2可知，HRFI組RFI、采食量極顯著高于LRFI組(P<0.01)，2組之間RFI差值達(dá)到了63.35 g/d，采食量差值達(dá)到了57.00 g/d。HRFI組料蛋比極顯著高于LRFI組(P<0.01)。2組之間增重、平均蛋重、產(chǎn)蛋率和體重均無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明RFI的高低對(duì)蛋鴨體重、增重、平均蛋重和產(chǎn)蛋率沒有顯著影響。

表2 不同RFI蛋鴨生產(chǎn)性能比較Table 2 Comparison of performance of laying ducks with different RFI

2.2 Alpha多樣性分析

2.2.1 稀釋曲線和相對(duì)豐度等級(jí)曲線

由圖1可知，稀釋曲線圖中，HRFI組各樣本稀釋曲線較LRFI組短且更平緩，說(shuō)明LRFI組物種相對(duì)豐度較HRFI組高。相對(duì)豐度等級(jí)曲線圖中，LRFI組相對(duì)豐度等級(jí)曲線在垂直方向上較為平緩且在水平方向上跨度較大；HRFI組各樣品相對(duì)豐度等級(jí)曲線在垂直方向上與LRFI組差異不大，在水平方向上跨度均較小，說(shuō)明LRFI組相對(duì)豐度等級(jí)較HRFI組高，但物種分布均勻度差異不大。

H：高剩余采食量組 HRFI group；L：低剩余采食量組 LRFI group。

2.2.2 Alpha多樣性指數(shù)分析

由圖2可知，LRFI組Chao1指數(shù)顯著高于HRFI組(P=0.018 9)，說(shuō)明LRFI組在菌群豐富度上高于HRFI組；LRFI組Shannon指數(shù)顯著高于HRFI組(P=0.025 7)，說(shuō)明LRFI組菌群多樣性高于HRFI組；HRFI組和LRFI組Simpson指數(shù)均高于0.95，并且LRFI組高于HRFI組(P>0.05)，說(shuō)明HRFI組和LRFI組的組內(nèi)菌群多樣性和均勻度均較高。

圖2 不同RFI組盲腸微生物Alpha多樣性Fig.2 Alpha diversity of cecal microorganisms of different RFI groups

2.2.3 Beta多樣性分析

由圖3可知，由PCoA圖可見，HRFI組與LRFI組的微生物群落分離明顯，表明2組樣本菌群結(jié)構(gòu)存在差異，主坐標(biāo)1占比55.57%，主坐標(biāo)2占比13.25%；由PCA圖可見，主成分1占比12.17%，主成分2占比8.69%；由NMDS圖可見，落在<0.2內(nèi)的點(diǎn)占絕大多數(shù)，表明數(shù)據(jù)分析可靠性高。

圖3 不同RFI組PCoA、PCA和NMDS圖Fig.3 PCoA, PCA and NMDS figures of different RFI groups

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 門水平上菌群結(jié)構(gòu)

由圖4可知，在門水平上，LRFI組蛋鴨腸道優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(Firmicutes)，HRFI組優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(Proteobacteria)，而擬桿菌門(Bacteroidetes)在2組中差異較小。2組物種相對(duì)豐度排名前5的菌群包括Bacteroidetes(50.6%)、Firmicutes(31.43%)、Proteobacteria(7.17%)、梭桿菌門(Fusobacteria)(4.06%)和脫鐵桿菌門(Deferribacteres)(2.00%)。其中，HRFI組Proteobacteria、Fusobacteria、Deferribacteres和Bacteroidetes相對(duì)豐度較LRFI組高，分別高2.12%、1.53%、1.31%和0.99%；而LRFI組僅Firmicutes相對(duì)豐度較HRFI組高，高4.75%。

圖4 HRFI組和LRFI組門水平優(yōu)勢(shì)菌群Fig.4 Dominant flora of HRFI group and LRFI group at phylum level

2.3.2 屬水平上菌群結(jié)構(gòu)

根據(jù)操作分類單元(OTUs)結(jié)果在屬水平對(duì)2組排名前10的微生物菌屬進(jìn)行分析。由圖5可知，2組相對(duì)豐度排名前10的微生物菌屬組成相同，包括擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、普雷沃氏菌科_Ga6A1(Prevotellaceae_Ga6A1_group)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、理研菌科_RC9(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、脫鐵桿菌屬(Mucispirillum)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、瘤胃菌科_UGG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)和副桿菌屬(Parabacteroides)。其中，HRFI組Bacteroides、Faecalibacterium、Anaerobiospirillum、Mucispirillum和Fusobacterium相對(duì)豐度均高于LRFI組，分別高3.71%、2.68%、2.09%、1.81%和1.53%；而LRFI組其余5個(gè)菌屬總相對(duì)豐度比HRFI組高1.57%，其他未知微生物菌屬相對(duì)豐度比HRFI組高7.90%。

圖5 HRFI組和LRFI組屬水平上排名前10的微生物菌屬Fig.5 Top 10 microorganism genus in HRFI group and LRFI group at genus level

2.4 不同RFI個(gè)體盲腸菌群差異分析

為分析HRFI組和LRFI組的差異菌群，進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。由圖6可知，在屬水平，共有18個(gè)差異菌群，其中HRFI組僅有支原體屬(Mycoplasma)相對(duì)豐度極顯著高于LRFI組(P<0.01)；LRFI組中，Rikenellaceae_RC9_gut_group、產(chǎn)糞甾醇真桿菌([Eubacterium]_coprostanoligenes_group)、瘤胃菌科_UGG-010(Ruminococcaceae_UCG-010)、巴氏桿菌(Barnesiella)、瘤胃球菌屬_2(Ruminococcus_2)、乳梭菌屬(Lachnoclostridium)、瘤胃菌科_NK4A214(Ruminococcaceae_NK4A214_group)、瘤胃菌科_UCG-009(Ruminococcaceae_UCG-009)、斯萊克氏菌屬(Olsenella)、艾伯森桿菌屬(Eisenbergiella)、互營(yíng)球菌屬(Syntrophococcus)、艾諾瑪菌屬(Enorma)、大腸桿菌-至賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、小紡錘狀菌屬(Fusibacter)相對(duì)豐度顯著高于HRFI組(P<0.05)，克里斯滕森菌科_R-7(Christensenellaceae_R-7_group)、顫桿菌克屬(Oribacterium)、乳頭桿屬(Papillibacter)相對(duì)豐度極顯著高于HRFI組(P<0.01)。

圖6 屬水平上HRFI組和LRFI組組間菌群差異分析Fig.6 Analysis of bacterial community differences between HRFI and LRFI groups at genus level

3 討 論

3.1 不同RFI對(duì)蛋鴨生產(chǎn)性能的影響

本研究顯示，HRFI組蛋鴨采食量、RFI和料蛋比均極顯著高于LRFI組，而RFI對(duì)蛋鴨體重、增重、平均蛋重、產(chǎn)蛋率均無(wú)顯著影響。之前在紹興鴨和縉云麻鴨上的研究表明，RFI與采食量呈極顯著正相關(guān)[10]，而在北京肉鴨上的研究表明，RFI與采食量、飼料轉(zhuǎn)化率呈中度正相關(guān)[25]，這與本研究結(jié)果一致。對(duì)奶牛的研究表明，RFI最低的個(gè)體比RFI最高的個(gè)體節(jié)約了15%的飼料[26]，而選育低RFI的肉牛也能達(dá)到顯著減少飼料消耗的目的[27]。對(duì)羊的研究表明，RFI與干物質(zhì)采食量呈顯著正相關(guān)，而RFI對(duì)羊體重、平均日增重等無(wú)顯著影響[28]，這與本研究結(jié)果一致。

3.2 不同RFI對(duì)蛋鴨盲腸微生物多樣性的影響

大量研究表明，畜禽的生產(chǎn)性能、飼料利用率和RFI與腸道微生物的組成存在相關(guān)性。本研究將同一場(chǎng)地內(nèi)相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件且遺傳背景相似的紹興鴨分成HRFI和LRFI組，通過比較盲腸微生物多樣性和差異菌群，嘗試在盲腸微生物與RFI之間建立聯(lián)系。對(duì)豬[29-31]和雞[21]腸道微生物與飼料轉(zhuǎn)化率的關(guān)聯(lián)研究表明，飼料轉(zhuǎn)化率高的個(gè)體Alpha多樣性更高或趨于更高。本研究中，豐富度曲線、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均表明LRFI組菌群Alpha多樣性高于HRFI組，與之前的研究結(jié)果一致。

3.3 不同RFI對(duì)蛋鴨門水平上盲腸微生物結(jié)構(gòu)的影響

本研究中，在門水平上，LRFI組蛋鴨腸道優(yōu)勢(shì)菌群為Firmicutes，HRFI組優(yōu)勢(shì)菌群為Proteobacteria，而Bacteroidetes在2組中差異較小。El等[32]研究表明，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes為主要編碼碳水化合物活性酶的菌群。腸道內(nèi)Firmicutes與Bacteroidetes的比例(F/B)會(huì)影響宿主從食物中獲取能量的能力[33]。對(duì)大鼠的研究表明，在食物誘導(dǎo)的肥胖個(gè)體中F/B更高[34]。肥胖人群中Bacteroidetes相對(duì)豐度高于較瘦人群，當(dāng)持續(xù)減少攝入的熱量，體重逐漸降低，F(xiàn)irmicutes相對(duì)豐度逐漸減小[35]。Firmicutes是不同RFI豬群腸道的主要差異菌群[36]。Han等[37]研究了不同體重?cái)嗄套胸i腸道菌群的差異，在體重較高的仔豬腸道中，F(xiàn)irmicutes對(duì)豐度高于體重較低的個(gè)體；相反，Bacteroidetes和Proteobacteria對(duì)豐度在體重較低的個(gè)體中更高。這與在人和哺乳動(dòng)物上的研究結(jié)果相似，家禽盲腸中Firmicutes相對(duì)豐度與體增重[38]和產(chǎn)蛋性能[22]存在正相關(guān)。另一項(xiàng)研究表明，早期在雞上使用抗生素會(huì)減少Firmicutes相對(duì)豐度，增加Proteobacteria相對(duì)豐度；在后期，低Firmicutes相對(duì)豐度的個(gè)體T細(xì)胞免疫活性降低[38]，揭示了Firmicutes和Proteobacteria對(duì)宿主免疫功能的影響。

3.4 不同RFI對(duì)蛋鴨屬水平上盲腸微生物結(jié)構(gòu)的影響

在屬水平上，HRFI組與LRFI組蛋鴨腸道菌群相對(duì)豐度排名前10的菌屬相同，其中LRFI組Rikenellaceae_RC9_gut_group、Phascolarctobacterium和Parabacteroides相對(duì)豐度高于HRFI組。Rikenellaceae是產(chǎn)蛋雞相對(duì)豐度最高的3個(gè)菌群之一[40]，同時(shí)也是肉雞[21]和豬[10]盲腸中的優(yōu)勢(shì)菌群，可以促進(jìn)飼糧中蛋白質(zhì)和碳水化合物的分解[41]。對(duì)大鼠的研究表明，在飼糧中添加高水平的脂肪，Phascolarctobacterium和Parabacteroides相對(duì)豐度隨之升高，且二者的相對(duì)豐度可能與體增重、體脂率以及代謝水平的變化有關(guān)[42]。此外，Parabacteroides可以通過誘導(dǎo)抗炎因子的產(chǎn)生以及抑制炎癥因子的分泌減少腸道炎癥反應(yīng)，維持腸道正常功能[17]。

3.5 不同RFI對(duì)蛋鴨盲腸微生物結(jié)構(gòu)差異的影響

本研究中，HRFI組和LRFI組蛋鴨存在18個(gè)差異菌群，其中HRFI組僅Mycoplasma相對(duì)豐度顯著高于LRFI。之前的研究顯示，Mycoplasma將碳水化合物作為主要能量物質(zhì)，且在正常飼喂條件下哺乳動(dòng)物腸道中很少見Mycoplasma[43]，豬糞便中Mycoplasma相對(duì)豐度與丁酸含量呈正相關(guān)[29]，膳食纖維組仔豬腸道菌群中Mycoplasma相對(duì)相對(duì)豐度顯著降低，表明Mycoplasma可能與宿主競(jìng)爭(zhēng)性利用碳水化合物，且不能幫助代謝不易消化吸收的膳食纖維，進(jìn)而影響宿主飼料利用率。其余17個(gè)差異菌群中12個(gè)為厚壁菌門，2個(gè)為擬桿菌門。其中厚壁菌門的[Eubacterium]_coprostanoligenes_group[30,44]、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)[30,42]、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)[36]和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)[45]對(duì)促進(jìn)宿主消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或提高飼料利用率有積極作用。

4 結(jié) 論

LRFI組蛋鴨盲腸微生物多樣性較高，2組菌群結(jié)構(gòu)存在差異。門水平上，LRFI組蛋鴨盲腸優(yōu)勢(shì)菌群為Firmicutes，HRFI組優(yōu)勢(shì)菌群為Proteobacteria；屬水平上，LRFI組Christensenellaceae_R-7_group、Oribacterium、Papillibacter等17個(gè)菌群相對(duì)豐度高于HRFI組，而HRFI組僅Mycoplasma相對(duì)豐度高于LRFI組。