紫蘇餅對大鯢消化道結構功能、免疫及脂質代謝部分指標的影響

劉長江 王光花 李偉龍 徐杭忠 李 虹 翟旭亮 薛 洋 劉天驥 李洪琴 劉 匆 羅 莉**

(1.西南大學水產學院，淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，重慶 400715；2.四川新希望六和科技創新有限公司，成都 610000；3.重慶市水產技術推廣總站，重慶 400400)

紫蘇(Perillafrutescens)又名赤蘇、紅蘇，系唇形科1年生草本植物，廣泛分布于我國浙江、四川、貴州、安徽及廣東等多個省份，至今已有2 000多年的種植歷史，是國家衛生部首批頒布的“藥食同源”的60種物種之一，富含揮發油、酚酸及黃酮類等生物活性成分。紫蘇餅是紫蘇籽榨油后的副產物，其中殘余了許多紫蘇籽中的活性物質，如木屑草素、迷迭香酸和亞麻油等，具有抗氧化、抑菌、抗炎等功能，且硫苷和棉酚等抗營養因子極少，經微生物發酵后，大分子蛋白質降解為小分子多肽，易被機體消化吸收。且發酵過程中產生的益生菌、乳酸及未知生長因子等能有效維護機體健康。

大鯢(Andriasdavidianus)是我國二級保護動物。目前，大鯢人工養殖過程中常以冰鮮為主要餌料，易引發大鯢胃腸、肝臟等消化道疾病和病毒性疾病等，造成很大的經濟損失。本研究團隊基于大鯢產業中面臨的問題，經多年研究，創制大鯢飼料并示范成功[1-2]。

基于此，為進一步優化飼料配方，促進大鯢配合飼料的優質高效綠色化，提高抗病能力，同時推廣藥食性資源的利用，本試驗以大鯢為研究對象，探討紫蘇餅和發酵紫蘇餅對大鯢生長性能、消化道結構功能、免疫及脂質代謝部分指標的影響，為紫蘇餅在大鯢配合飼料中的合理應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所需大鯢(陜西種，子2代)購買于陜西省漢中市綠源大鯢養殖場；紫蘇餅由忠縣湘楠農業開發有限公司提供，其余原料均由重慶新希望飼料有限公司提供。

1.2 試驗飼料

根據大鯢的營養需求，配合飼料以魚粉、雞肉粉和魚油等為原料配制，對照組飼喂配合飼料，微調配方，分別添加5.0%的紫蘇餅(紫蘇餅組)和發酵紫蘇餅(發酵紫蘇餅組)(發酵紫蘇餅利用乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌復合菌種發酵而來，試驗開展前已篩選出適宜的發酵比例及條件，發酵前后營養成分變化見表1)，配制成3種等氮等脂的試驗飼料。試驗飼料組成及營養水平見表2。

表1 紫蘇餅發酵前后營養成分變化(干物質基礎)Table 1 Changes in nutritional components of perilla cake before and after fermentation (DM basis)

續表2項目 Items對照組Control group紫蘇餅組Perilla cake group發酵紫蘇餅組Fermented perilla cake group紫蘇餅 Perilla cake5.00發酵紫蘇餅 Fermented perilla cake5.00復合蛋白粉 Compound protein powder1)16.6014.5514.05α-預糊化淀粉 α-pregelatinized starch10.8010.8010.80魚油 Fish oil5.004.154.15磷酸二氫鈣 Ca(H2PO4)21.501.501.50羧甲基纖維素鈉 Sodium carboxymethyl cellulose0.500.500.50預混料 Premix2)4.424.424.42膨潤土 Bentonite0.880.070.43微晶纖維素 Microcrystalline cellulose1.300.010.15合計 Total100.00100.00100.00營養水平(干物質基礎) Nutrient levels (DM basis)3)粗蛋白質 CP56.70 56.9656.73粗脂肪 EE11.62 11.69 11.60 粗灰分 Ash13.08 12.26 12.66

表2 試驗飼料組成及營養水平(風干基礎)Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

1.3 飼養管理

正式試驗前，先將大鯢以對照組飼料馴食15 d。馴食完成后，選擇96尾初始體質量為(54.14±0.17) g的健康大鯢，隨機分為3組，每組4個重復，每個重復8尾，飼養于西南大學水產學院大鯢養殖系統中，單口藍色箱子規格：70 cm×45 cm×17.5 cm，水深5 cm，水源為曝氣自來水，每天早、晚各100%換水1次。因大鯢消化食物時間較長，故連續投喂2 d(17:30)后停食1 d。投喂3 h后撈取殘餌，收集到殘餌杯。正式飼喂試驗時間105 d，期間無光照，利用空調維持水溫22～25 ℃，溶解氧含量>6.0 mg/L，總氨氮含量<0.10 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.01 mg/L，pH 6.5～7.5。

1.4 樣品采集

大鯢養殖試驗結束后饑餓72 h，每組每個重復隨機選取6尾大鯢用適量MS-222麻醉，稱重后用1 mL的1次性無菌注射器在尾靜脈處取血，4 500 r/min離心10 min制備血漿放入液氮罐中速凍后，轉入-80 ℃冰箱內保存，用于血漿生化指標測定。后將大鯢于冰上解剖，取出完整內臟團和肝臟，分離胃、腸道和背部肌肉樣品，液氮速凍后，轉入-80 ℃冰箱保存備用。

a：對照組小腸(40×)：b：紫蘇餅組小腸(40×)：c：發酵紫蘇餅組小腸(40×)；d：對照組小腸(100×)；e：紫蘇餅組小腸(100×)；f：發酵紫蘇餅組小腸(100×)。

1.5 指標測定

生長指標：養殖試驗結束后，停食72 h(確保其空腸)，準確稱量各組大鯢體質量、飼料質量及殘餌重，計算公式如下：

增重率(weight gain rate, WGR, %)=
100×(Wt-W0)/W0；
特定生長率(specific gain rate, SGR, %/d)=
100×(lnWt-lnW0)/D；
飼料系數(feed conversion rate, FCR)=
F/(Wt-W0)；
存活率(survival rate，%)=100×Nt/N0。

式中:W0為初始尾均重(g)；Wt為終末尾均重(g)；D為養殖試驗天數；F為尾均干物質攝食量(g)；N0為初始尾數；Nt為終末尾數。

試驗飼料及肌肉常規營養成分測定：水分含量測定采用105 ℃烘箱干燥法(GB/T 6435—2006)，粗蛋白質含量測定采用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)，粗脂肪含量測定采用索氏抽提法(GB/T 6433—1994)。

血漿和組織生化指標的測定：胃中胃蛋白酶、氫鉀ATP酶(H+-K+-ATP酶)活性；腸道胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATP酶)活性;肝臟和腸道總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；血漿二胺氧化酶(DAO)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)活性及內毒素(ET)、D-乳酸(D-LA)、免疫球蛋白M(IgM)、一氧化氮(NO)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量分別采用南京建成生物工程研究所試劑盒或上海優選生物科技有限公司酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒進行測定。

腸道石蠟組織切片：由武漢塞維爾生物科技有限公司代制，切片為蘇木精-伊紅(HE)染色，用MIPlus07測量腸道絨毛高度、數量和空腔面積。

1.6 數據處理

試驗結果用SPSS 22.0對數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)。用Duncan氏多重比較法分析組間差異顯著性程度，顯著水平為P<0.05。數據用平均值±標準差(mean±SD)形式表示。

2 結 果

2.1 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢生長性能和飼料利用的影響

大鯢FBW、WGR和SGR趨勢均為發酵紫蘇餅組顯著高于對照組和紫蘇餅組(P<0.05)，且紫蘇餅組顯著高于對照組(P<0.05)；FCR和存活率各組間差異不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢生長性能及飼料利用的影響Table 3 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on growth performance and feed utilization of Andrias davidianus (n=4)

2.2 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢胃消化吸收能力的影響

發酵紫蘇餅組胃中胃蛋白酶和H+-K+-ATP酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，較對照組分別提高了27.40%和29.96%；紫蘇餅組胃H+-K+-ATP酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，較對照組提高了19.33%(表4)。

表4 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢胃消化吸收能力的影響Table 4 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on stomach digestion and absorption capacity of Andrias davidianus (n=4) U/mg

2.3 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢腸消化吸收和屏障功能的影響

發酵紫蘇餅組腸道脂肪酶和淀粉酶活性均顯著高于紫蘇餅組和對照組(P<0.05)，其中，脂肪酶活性較對照組提高了68.38%，淀粉酶活性比紫蘇餅組和對照組分別提高了21.62%和150.00%；腸道胰蛋白酶和Na+-K+-ATP酶活性均在紫蘇餅組出現最大值，其中胰蛋白酶活性顯著高于其余2組(P<0.05)，且較對照組提高了102.37%，腸道Na+-K+-ATP酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，但與發酵紫蘇餅組相比差異不顯著(P>0.05)；血漿DAO活性、ET和D-LA含量均在發酵紫蘇餅組出現最小值，發酵紫蘇餅組血漿DAO活性和D-LA含量與紫蘇餅組相比差異不顯著(P>0.05)，但均顯著低于對照組(P<0.05)且較對照組分別降低了42.79%和113.52%，而血漿ET含量顯著低于紫蘇餅組和對照組(P<0.05)(表5)。

表5 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢腸道消化吸收能力和屏障功能的影響Table 5 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on digestion and absorption capacity and intestinal barrier function of Andrias davidianus (n=4)

2.4 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢腸道形態結構的影響

對照組和紫蘇餅組、發酵紫蘇餅組的絨毛數量和絨毛高度無顯著差異(P>0.05)；發酵紫蘇餅組大鯢腸道空腔率顯著低于其他2組，較對照組降低了40.38%(P<0.05)(表6和圖1)。

表6 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢腸道形態結構的影響Table 6 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on intestinal structure of Andrias davidianus (n=4)

2.5 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢肝臟和腸道抗氧化能力的影響

在肝臟中，發酵紫蘇餅組T-AOC顯著高于其余2組(P<0.05)，T-SOD活性顯著高于對照組(P<0.05)，但與紫蘇餅組差異不顯著(P>0.05)；在腸道中，紫蘇餅組T-AOC顯著高于發酵紫蘇餅組和對照組(P<0.05)；發酵紫蘇餅組T-SOD活性出現最大值，并顯著高于其余2組(P<0.05)；MDA含量為發酵紫蘇餅組<紫蘇餅組<對照組，3組間差異顯著(P<0.05)(表7)。

表7 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢肝臟和腸道抗氧化能力的影響Table 7 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on liver and gut intestinal antioxidant of Andrias davidianus (n=4)

2.6 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢免疫和肝功能指標的影響

紫蘇餅組血漿IgM含量與發酵紫蘇餅組差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于對照組(P<0.05)且紫蘇餅組較對照組提高了31.48%；血漿NO含量和AST活性各組間差異不顯著(P>0.05)；發酵紫蘇餅組血漿ALT活性顯著低于其余2組(P<0.05)(表8)。

表8 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢免疫和肝功能指標的影響Table 8 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on immunity and liver function indexes of Andrias davidianus (n=4)

2.7 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢脂質代謝部分指標的影響

血漿TC和TG含量均在發酵紫蘇餅組出現最小值，且均顯著低于對照組(P<0.05)；各組血漿HDL-C含量差異不顯著(P>0.05)；紫蘇餅組血漿LDL-C含量與發酵紫蘇餅組差異不顯著(P>0.05)，但均顯著低于對照組(P<0.05)(表9)。

表9 紫蘇餅與發酵紫蘇餅對大鯢脂質代謝部分指標的影響Table 9 Effects of perilla cake and fermented perilla cake on some lipid metabolism indexes of Andrias davidianus (n=4) mmol/L

3 討 論

3.1 紫蘇餅和發酵紫蘇餅提高了大鯢生長性能

紫蘇類原料因富含黃酮類、酚酸類等活性成分，對促進動物生長發育、改善肉質有一定效果，這在小鼠[4]、肉雞[5]等動物的試驗中已得到證實。本試驗所采用紫蘇餅是紫蘇籽榨油后的副產物，其中殘余了許多紫蘇籽中的活性物質，如木屑草素、迷迭香酸和亞麻油等，具有抗氧化、抑菌、抗炎等功能。發酵紫蘇餅是利用復合菌種發酵而來的，富含有益菌、乳酸、小肽及多種促生長因子。本研究表明，紫蘇餅和發酵紫蘇餅均促進大鯢的生長性能，其中發酵紫蘇餅促進效果更佳，與發酵工藝的產物相關，具體單一功能成分和復合功能成分組合有待進一步探討。

3.2 紫蘇餅和發酵紫蘇餅改善了大鯢胃腸功能

大量營養學研究表明，飼料成分會影響消化酶活性[6-7]。胃H+-K+-ATP酶是胃酸分泌的關鍵酶，Na+-K+-ATP酶則與腸道的吸收能力呈正相關，胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶是消化三大營養物質的重要酶,DAO、ET和D-LA活性三者均能評價腸道屏障功能，本研究中，可能是因為紫蘇餅中的多種天然活性物質及發酵加入的有益菌具有改善胃腸內環境，促進胃腸組織生長發育的作用，大鯢胃腸消化吸收功能及腸道屏障功能在發酵紫蘇餅組及紫蘇餅組有較大提升，其中發酵紫蘇餅經過發酵后，硫苷等抗營養因子及有害物質減少，且富含有機酸、可溶性肽、氨基酸等小分子物質，添加后效果更佳。

3.3 紫蘇餅和發酵紫蘇餅提高了大鯢抗氧化能力

紫蘇屬植物富含酚酸、黃酮類抗氧化活性物質，其抗氧化功效得到了中外學者的廣泛關注[8]。SOD活性、T-AOC和MDA含量可以綜合評價機體的抗氧化能力，本試驗中采用的紫蘇餅經發酵后，紫蘇餅中多糖、脂肪和蛋白質等大分子物質會被降解，生成有機酸、可溶性肽、氨基酸等小分子物質，紫蘇餅中富含的活性物質可以更好地在機體內釋放，用以清除各種氧化自由基。所以本研究發現，大鯢的腸肝抗氧化能力總體趨勢表現為“發酵紫蘇餅組>紫蘇餅組>對照組”。因此，可得出紫蘇餅和發酵紫蘇餅均具有提高大鯢對有氧代謝過程產生的超氧陰離子自由基的清除能力，這種自由基可侵犯細胞膜、血管壁、蛋白質、脂肪，甚至細胞核中的DNA。也有助于實現氧化與抗氧化系統達到平衡，促進細胞在受到各種有害刺激時的損傷后的修復，從而有益于腸肝的健康。

3.4 紫蘇餅和發酵紫蘇餅提高了大鯢肝臟和免疫功能

紫蘇籽中含有豐富的α-亞麻酸、紫蘇醛、木犀草素和迷迭香酸等活性成分，這些活性成分在提高機體免疫力，降低脂質過氧化及保護肝臟方面效果顯著[9-12]。宋代軍等[13]研究發現，在肉仔雞基礎飼糧中添加紫蘇籽提取物可以顯著增強肉仔雞的免疫能力，并推測與紫蘇籽提取物中多種活性成分密切相關。而紫蘇餅是紫蘇籽榨油后的副產物，紫蘇籽中多種活性成分殘余至其中。本試驗中，紫蘇餅和發酵紫蘇餅添加后大鯢血漿IgM含量有顯著提升，轉氨酶活性顯著降低，NO(氮自由基)含量差異不顯著。這說明紫蘇餅對大鯢同樣具有提高特異性免疫力，維護肝臟健康的作用。

3.5 紫蘇餅和發酵紫蘇餅優化了大鯢脂質代謝部分指標

動物機體脂質代謝的紊亂對機體健康存在巨大威脅。中醫藥學方面的研究已證實，紫蘇餅中富含的黃酮類化合物具有調節脂質代謝的能力[14]。本試驗中，紫蘇餅組和發酵紫蘇餅組的大鯢血漿TC、TG和LDL-C含量顯著降低，脂質代謝狀況得到明顯改善。這說明在大鯢飼料中添加適量紫蘇餅，可減少膽固醇在血管中的積累，提高鯢體健康水平。

4 結 論

本試驗條件下，飼料中添加5%的紫蘇餅或發酵紫蘇餅能促進大鯢生長性能，且發酵紫蘇餅的綜合效果優于紫蘇餅。二者均具有增強胃腸消化吸收能力及腸道屏障功能，增強機體抗氧化、免疫能力和降低膽固醇的作用。