飼料中添加丁酸鈉對黃顙魚幼魚非特異性免疫、抗氧化指標及腸道黏膜形態的影響

王海瑞 胡俊茹 趙紅霞* 曹俊明* 陳 冰 陳曉瑛

(1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.廣東省農業科學院動物科學研究所，農業農村部華南動物營養與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣州 510640；3.廣州飛禧特生物科技有限公司，廣州 510640)

有機酸是指一些具有酸性的有機化合物，包括檸檬酸、甲酸、丁酸、乳酸、丙酸和乙酸及其鹽類。飼料中添加有機酸能夠顯著改善水產動物的生長性能、提高礦物質的生物利用率、改善機體健康和增強免疫、抗氧化功能[1-2]。丁酸被認為是厭氧細菌發酵碳水化合物的衍生物之一，因其對腸道有益而受到越來越多的關注[3]。對奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究發現，腸道魚類微生物對碳水化合物的發酵導致了包括丁酸在內的短鏈脂肪酸分泌，這一潛在的丁酸來源可能有助于保護魚類免受病原菌的入侵[4-5]。丁酸鈉是丁酸與礦物質螯合形成的丁酸鹽，分子式為C4H7O2Na。丁酸鹽更加穩定，且氣味沒有丁酸強烈，因此更常用于魚類和畜禽飼料中。在歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)[6]、金頭鯛(Sparusaurata)[7]、金魚(Carassiusauratus)[8]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[9]、尖吻鱸(Latescalcarifer)[10]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[11]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[12]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[13]上的研究均表明丁酸或丁酸鈉有顯著的促生長作用。

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)，鯰形目、鲿科、黃顙魚屬，雜食性溫水魚類。黃顙魚分布范圍廣，全國各水域均有分布。近年來，隨著我國黃顙魚規模化養殖不斷增加，有關其健康狀況和病害防治方面的研究也在不斷增加。本實驗室前期研究表明，飼料中添加適宜水平的丁酸鈉能夠顯著提高黃顙魚的生長性能和營養物質沉積[14]。但是，關于飼料中添加丁酸鈉對黃顙魚組織器官免疫功能和腸道健康的研究尚未見報道。本試驗通過在飼料中添加不同水平的丁酸鈉，探討其對黃顙魚非特異性免疫、抗氧化指標和腸道黏膜形態的影響，為丁酸鈉在水產配合飼料中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

配制5種等氮等脂(42%的蛋白質和9%的脂肪)的試驗飼料，試驗飼料中丁酸鈉(純度≥99%)添加量分別為0、250、500、1 000和2 000 mg/kg。試驗飼料營養水平的設定等參照本實驗室配方[15]，試驗飼料組成及營養水平見表1。飼料原料粉碎后過60目篩，按照配方要求準確稱量，并逐級混勻后，加入魚油、豆油和30%的水，再次混合均勻后，用雙螺桿制粒機(SLX-80，華南理工大學科技實業總廠)擠壓成粒徑為1.5 mm的顆粒飼料，55 ℃烘干，冷卻后置于-20 ℃保存備用。

表1 試驗飼料組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) ‰

續表1項目 Items丁酸鈉添加量 SB supplemental levels/(mg/kg)0 250 5001 000 2 000 微晶纖維素Microcrystalline cellulose2.00 1.75 1.50 1.00 0.00 丁酸鈉 SB 0.25 0.50 1.00 2.00 合計 Total1 000.001 000.001 000.001 000.001 000.00營養水平 Nutrient levels3)粗蛋白質CP426423 420 425422 粗脂肪 EE90.1 87.790.185.6 84.5粗灰分 Ash82.5 81.981.983.084.2 水分 Moisture77.9 86.9 85.780.781.8

1.2 試驗魚與飼養管理

試驗用黃顙魚幼魚購自廣州市錦龍漁業有限公司，試驗地點為廣東省農業科學院動物科學研究所水產研究室室內循環水養殖系統。將采購的黃顙魚在室外水泥池中暫養2周，攝食未添加丁酸鈉的試驗飼料，每天投喂2次。試驗開始時，選取初始平均體重為(1.26±0.01) g黃顙魚幼魚600尾，隨機分為5組，每組3個重復，每個重復40尾魚，分別投喂5種試驗飼料。試驗飼料投喂量為黃顙魚體重的5%～6%，每天08:30和18:30各投喂1次，根據攝食情況調整投喂量，養殖試驗為期56 d。養殖系統采取循環水過濾系統，試驗魚飼養于圓柱形玻璃纖維桶(直徑80 cm，高70 cm)中，定期換水和測定水質。試驗期間水溫28～32 ℃，氨氮濃度<0.20 mg/L，亞硝酸鹽濃度<0.01 mg/L，溶氧濃度>6.0 mg/L，pH 7.4～7.9，自然光源。

1.3 樣品采集

養殖試驗結束后停食24 h，從每個重復隨機選取16尾魚，放入120 mg/L的MS-222溶液中麻醉。選取其中8尾于尾靜脈取血，4 000 r/min離心10 min，取上清液分裝制備血清，-80 ℃冰箱保存，用于非特異性免疫和抗氧化指標測定；5尾于冰上迅速解剖、剝離肝臟和腸道，-80 ℃冰箱保存，用于非特異性免疫和抗氧化指標測定；3尾于冰上迅速解剖，分別取其前、中、后腸置于固定液中保存，用于腸道組織石蠟切片制作。

1.4 指標測定

1.4.1 飼料營養成分分析

飼料中各營養成分含量參照AOAC(1984)[16]中方法進行檢測，其中水分含量采用105 ℃烘干干燥恒重法測定，粗蛋白質(氮×6.25)采用凱氏定氮法測定，粗脂肪含量采用索氏抽提法測定，粗灰分含量采用550 ℃高溫馬弗爐灰化法測定。

1.4.2 血清、肝臟、腸道中非特異性免疫和抗氧化指標測定

血清、肝臟、腸道中免疫和抗氧化指標均采用試劑盒檢測，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，具體測定方法參照試劑盒所附說明書，測定指標包括：溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)、一氧化氮合酶(NOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性與丙二醛(MDA)含量。

1.4.3 腸道黏膜形態觀察

腸道組織石蠟切片的制作和觀察在武漢谷歌生物科技有限公司完成。采用光學顯微鏡(100×)觀察前腸組織切片，并用成像系統進行圖像采集。利用Image-Pro Plus 6軟件對腸道組織絨毛長度、絨毛寬度和肌層厚度分別進行測定。

1.5 數據統計與分析

試驗數據用平均值±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。先對試驗數據開展方差齊性檢驗，滿足方差齊性條件則進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若存在顯著差異，再用Tukey’s檢驗方法進行多重比較；若方差齊性條件不滿足，則用Dunnett’s T3檢驗法進行多重比較。差異顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 飼料中添加丁酸鈉對黃顙魚幼魚非特異性免疫指標的影響

從表2可以看出，黃顙魚血清LZM和NOS活性在1 000 mg/kg丁酸鈉組達到最高值，血清AKP活性在250 mg/kg丁酸鈉組達到最高值，均顯著高于未添加組(P<0.05)。黃顙魚肝臟LZM和AKP活性在1 000 mg/kg丁酸鈉組達到最高值，顯著高于未添加組(P<0.05)。黃顙魚腸道AKP和NOS活性在500 mg/kg丁酸鈉組達到最高值，顯著高于未添加組和2 000 mg/kg丁酸鈉組(P<0.05)。飼料中添加丁酸鈉對黃顙魚血清、肝臟和腸道iNOS以及肝臟NOS活性和腸道LZM活性無顯著影響(P>0.05)。利用二次回歸模型擬合血清NOS活性和飼料丁酸鈉添加量，通過分析表明黃顙魚幼魚飼料中丁酸鈉的適宜添加量為1 275 mg/kg(圖1)。

表2 飼料中添加丁酸鈉對黃顙魚幼魚非特異性免疫指標的影響Table 2 Effects of dietary SB on non-specific immune indices of juvenile yellow catfish (n=3)

圖1 飼料中丁酸鈉添加量與黃顙魚幼魚血清NOS活性的關系Fig.1 Relationship between dietary SB supplemental level and serum NOS activity of juvenile yellow catfish

2.2 飼料中添加丁酸鈉對黃顙魚幼魚抗氧化指標的影響

由表3可以看出，與未添加組相比，飼料中添加2 000 mg/kg丁酸鈉顯著提高了黃顙魚血清CAT和GSH-Px活性(P<0.05)。1 000 mg/kg丁酸鈉組黃顙魚血清SOD和肝臟GSH-Px活性顯著高于未添加組(P<0.05)。500 mg/kg丁酸鈉組黃顙魚腸道SOD和CAT活性顯著高于未添加組(P<0.05)，500、1 000和2 000 mg/kg丁酸鈉組黃顙魚腸道GSH-Px活性顯著高于未添加組(P<0.05)，250、500、1 000和2 000 mg/kg丁酸鈉組腸道MDA含量顯著低于未添加組(P<0.05)。飼料中添加丁酸鈉對黃顙魚血清和肝臟MDA含量、肝臟SOD和CAT活性無顯著影響(P>0.05)。利用二次回歸模型擬合血清SOD活性和飼料丁酸鈉添加量，通過分析表明黃顙魚幼魚飼料中丁酸鈉的適宜添加量為1 218 mg/kg(圖2)。

表3 飼料中添加丁酸鈉對黃顙魚幼魚抗氧化指標的影響Table 3 Effects of dietary SB on antioxidant indices of juvenile yellow catfish (n=3)

圖2 飼料中丁酸鈉添加量與黃顙魚幼魚血清SOD活性的關系Fig.2 Relationship between dietary SB supplemental level and serum SOD activity of juvenile yellow catfish

2.3 飼料中添加丁酸鈉對黃顙魚幼魚腸道黏膜形態的影響

黃顙魚前腸、中腸和后腸的黏膜形態分別見圖3、圖4、圖5，黃顙魚腸道絨毛長度、絨毛寬度和肌層厚度見表4。與未添加組相比，飼料中添加500或1 000 mg/kg丁酸鈉顯著提高了黃顙魚前腸的絨毛長度、絨毛寬度和肌層厚度(P<0.05)。250、500和1 000 mg/kg丁酸鈉組黃顙魚后腸的絨毛長度和肌層厚度顯著高于未添加組(P<0.05)。飼料中添加丁酸鈉對黃顙魚中腸的絨毛長度、絨毛寬度、肌層厚度和后腸的絨毛寬度沒有顯著影響(P>0.05)。利用二次回歸模型擬合前腸絨毛長度和飼料丁酸鈉添加量，通過分析表明黃顙魚幼魚飼料中丁酸鈉的適宜添加量為1 489 mg/kg(圖6)。

圖6 飼料中丁酸鈉添加量與黃顙魚幼魚前腸絨毛長度的關系Fig.6 Relationship between dietary SB supplemental level and villus length of proximal intestine of juvenile yellow catfish

表4 飼料中添加丁酸鈉對黃顙魚幼魚腸道絨毛長度、絨毛寬度和肌層厚度的影響Table 4 Effects of dietary SB on intestinal villus length, villus width and muscular thickness of juvenile yellow catfish (n=3) μm

續表4項目 Items丁酸鈉添加量 SB supplemental levels/(mg/kg)0250500 1 0002 000后腸 Distal intestine絨毛長度Villus length251.72±30.27a303.91±19.29b321.35±30.46b327.42±27.99b281.77±21.63ab絨毛寬度Villus width 87.93±18.3294.99±17.3181.61±20.9899.85±17.6289.38±22.45肌層厚度Muscular thickness 54.75±6.20a75.77±12.03b70.36±7.53b72.81±6.95b62.94±6.68ab

圖4 黃顙魚幼魚中腸黏膜形態Fig.4 Mid intestine mucosal morphology of juvenile yellow catfish

圖5 黃顙魚幼魚后腸黏膜形態Fig.5 Distal intestine mucosal morphology of juvenile yellow catfish

3 討 論

有機酸(檸檬酸、甲酸、丁酸等及其鹽類)在促進生長和增強抗病力等方面發揮的作用已受到廣泛關注。飼料中添加有機酸能夠顯著改善水產動物的生長性能和提高礦物質的生物利用率。本實驗室前期研究發現，飼料中添加丁酸鈉能夠顯著促進黃顙魚生長發育和提高飼料營養物質利用效率，以增重率為評價指標，丁酸鈉在飼料中的適宜添加量為1 150.50 mg/kg[14]。本試驗以黃顙魚血清NOS、SOD活性和前腸絨毛長度為評價指標，通過二次回歸分析得出黃顙魚飼料中丁酸鈉的適宜添加量分別為1 275、1 218和1 489 mg/kg。

3.1 丁酸鈉對黃顙魚幼魚非特異性免疫指標的影響

魚類和哺乳動物相似，具有非特異性和特異性免疫功能，通過血液、黏膜屏障和組織中各種免疫細胞和因子協同抵御病原侵襲[17]。非特異性免疫是魚類免疫系統中的重要組成部分，主要由免疫酶和免疫因子構成，包括LZM、酸性磷酸酶(ACP)、AKP、NOS、凝集素和溶血素等。研究顯示，飼料中添加0.2%和0.3%微囊化丁酸鈉顯著提高了歐洲鱸血清總免疫球蛋白含量、呼吸爆發活性、吞噬活性、吞噬指數、LZM活性和殺菌活性[6]。飼料中添加部分包膜丁酸鈉可顯著提高尼羅羅非魚血清中LZM活性、呼吸爆發活性、殺菌活性和凝集活性[18]。Aalamifar等[10]研究發現，添加丁酸的飼料顯著提高了卵形鯧鲹血清總蛋白、LZM、呼吸爆發活性和溶血活性。Mirghaed等[19]研究發現，飼料中添加1.5～5.0 g/kg丁酸鈉能夠顯著增強虹鱒的非特異性免疫功能，如激活腸道的LZM活性及殺菌活性。與上述研究結果一致，本試驗中，飼料中添加一定量的丁酸鈉顯著提高了黃顙魚血清LZM、NOS、AKP活性，肝臟LZM、AKP活性及腸道AKP、NOS活性，表明飼料中添加適量丁酸鈉能夠增強黃顙魚的非特異性免疫功能。然而，在尼羅羅非魚飼料中添加丁酸鈉對血液紅細胞計數、紅細胞比容積、血紅蛋白濃度和白細胞計數均無顯著影響[20]。攝食含不同丁酸鈉水平的飼料后，巨骨舌魚的血液學參數如免疫球蛋白、總蛋白、甘油三酯、葡萄糖和膽固醇含量均沒有顯著差異[21]。本試驗也發現，飼料中添加丁酸鈉對黃顙魚血清、肝臟和腸道iNOS以及肝臟NOS和腸道LZM活性均無顯著影響。丁酸鈉對魚體免疫功能的影響可能與養殖對象、組織器官、飼料組成、丁酸鈉添加量、養殖條件等有關。目前，關于丁酸鈉對水產動物免疫功能影響的研究還比較少，其作用機制還有待于進一步深入研究。

3.2 丁酸鈉對黃顙魚幼魚抗氧化指標的影響

魚類細胞的氧化應激是由于超氧陰離子、羥自由基等活性氧過量產生而引發的，其會引起脂質、蛋白質及暴露細胞DNA的嚴重氧化損傷，最終導致細胞凋亡[22]。魚類主要通過2種機制減輕氧化損傷：1)提高GSH-Px、CAT、SOD和過氧化物酶(POD)等抗氧化酶的活性；2)產生還原型谷胱甘肽等抗氧化物質[23]。這些機制有助于減少活性氧的產量。魚類血清、肝臟及腸道等組織中的抗氧化酶和抗氧化物也被認為是氧化應激的指示因子。此外，MDA、巴比妥酸反應物質(TBARS)和蛋白羰基(PC)含量可用于評估魚類細胞內脂質和蛋白質的氧化損傷程度[24]。本試驗中，飼料中添加一定量的丁酸鈉顯著提高了黃顙魚血清和腸道CAT、SOD活性及血清、肝臟和腸道GSH-Px活性，并顯著降低了腸道MDA含量，表明飼料中添加適量的丁酸鈉能夠有效增強黃顙魚的抗氧自由基能力。與本研究結果相似，飼料中添加丁酸鈉可以顯著提高美洲鰻和黃鱔肝臟中總抗氧化能力(T-AOC)、SOD和CAT活性，降低MDA含量[25-26]。在草魚中的研究也表明，飼料添加丁酸鈉顯著增加了肝臟SOD和GSH-Px活性，但對T-AOC和MDA含量沒有顯著影響[27-28]。在石斑魚中的研究發現，飼料中添加1%的丁酸鈉顯著降低了石斑魚血清TBARS含量[29]。高植物蛋白質飼料中添加0.3%的丁酸鈉顯著提高了大菱鲆幼魚肝臟T-AOC和CAT活性，降低了肝臟MDA含量[30]。強俊等[31]研究報道，魚類通過增加代謝來應對環境脅迫，氧自由基的產生也隨之增加，SOD與CAT活性的增加可視為生物體對新陳代謝的適應，以減輕脂質過氧化損傷。因此，丁酸鈉可能通過增加體內抗氧化酶活性，降低氧化應激損傷，減少體內自由基的產生。

3.3 丁酸鈉對黃顙魚幼魚腸道黏膜形態的影響

魚類腸道健康與腸道絨毛形態結構、細菌數量、消化酶活性等休戚相關。改善魚類腸道組織形態，如絨毛長度、絨毛寬度、肌層厚度等，有助于提高營養物質的消化率，維護魚體健康[12]。丁酸鈉改善腸道物理屏障結構，主要表現為腸道皺壁高度和肌層厚度的增加[32]。攝食添加丁酸鈉飼料的鞍帶石斑魚腸道黏膜上皮層排列有序，固有層致密[29]。鄭瑞耕[33]發現，飼料中添加丁酸鈉顯著提高了鯉魚中腸的絨毛長度、絨毛寬度和肌層厚度。飼料中添加0.2%的微囊丁酸鈉增加了歐洲鱸的腸道肌層厚度、杯狀細胞數量、絨毛長度和絨毛寬度[6]。飼料中添加丁酸鈉顯著增加了草魚腸道絨毛長度[34]。本試驗測定了黃顙魚前腸、中腸和后腸的物理屏障結構，發現飼料中添加500 mg/kg丁酸鈉顯著提高了黃顙魚前腸的絨毛長度、絨毛寬度、肌層厚度和后腸的絨毛長度、肌層厚度，表明丁酸鈉有助于促進黃顙魚腸道發育和維護腸道健康。丁酸鹽已被證實能夠為動物提供能量來源，并作為調節機體能量代謝的信號分子發揮重要作用，丁酸鹽的高能量值可以為腸道上皮組織的恢復提供能量[35-36]。研究表明，飼料中添加微囊丁酸鈉后，飼喂氧化大豆油飼料對鯉魚腸道黏膜形態沒有負面影響[11]。低魚粉低魚油飼料中添加0.4%丁酸鈉飼養金頭鯛9周，發現丁酸鈉通過調節炎癥反應、激活抗氧化系統、改變黏液分泌相關基因的表達、改變上皮細胞連接和減少跨膜電阻等促使腸道功能恢復至正常狀態[37]。飼料中添加丁酸鈉提高了黃鱔腸道絨毛高度與隱窩深度的比值，降低了隱窩深度，對腸道黏膜組織顯著修復[25]。此外，丁酸鈉還能夠緩解和恢復高豆粕飼料導致的歐洲鱸后腸炎癥反應[38]。

4 結 論

① 飼料中添加適量丁酸鈉可顯著提高黃顙魚幼魚血清LZM、NOS和AKP活性，肝臟LZM和AKP活性以及腸道AKP和NOS活性。

② 飼料中添加適量丁酸鈉顯著提高黃顙魚幼魚血清和腸道CAT、SOD活性及血清、肝臟和腸道GSH-Px活性，并顯著降低腸道MDA含量。

③ 飼料中添加適量丁酸鈉可顯著提高黃顙魚幼魚前腸的絨毛長度、絨毛寬度、肌層厚度和后腸的絨毛長度、肌層厚度。

④ 以黃顙魚血清NOS、SOD活性和前腸絨毛長度為評價指標，通過二次回歸分析得出黃顙魚幼魚飼料中丁酸鈉的適宜添加量分別為1 275、1 218和1 489 mg/kg。