低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞生長性能、肝臟生長基因及雷帕霉素靶蛋白信號通路基因表達的影響

張靜靜 鄭 旭 李 玥 朱隨亮 王世瓊 張 薇 喬英英 劉長忠 王志祥*

(1.河南農業大學動物科技學院，鄭州 450002；2.河南科技學院，新鄉 453003)

近年來，低碳養殖受到人們的高度重視，2018年10月26日，中國飼料工業協會發布了《仔豬、生長育肥豬配合飼料》和《蛋雞、肉雞配合飼料》2項團體標準，這2項標準的重點是降低飼糧中粗蛋白質水平，提倡高度有效的低蛋白質飼糧體系在畜牧業中的應用，推動養殖業綠色發展。低蛋白質飼糧是一種通過降低飼糧2～4個百分點粗蛋白質水平，并通過添加適宜種類和比例的氨基酸，對動物生長性能不造成影響的氨基酸平衡飼糧[1]。研究表明，酶制劑應用在配合飼料中對動物的生產性能有提高的作用，不僅可以減少蛋白質原料的使用，節約飼料成本，提高飼糧粗蛋白質的利用率，提高經濟效益，而且也能減少氮排放對環境造成的污染[2-3]。飼糧添加外源蛋白酶對畜禽的生長尤其幼齡動物有良好的作用效果[4]。不過，目前尚不明確蛋白酶是如何通過影響肉仔雞分子機制的表達，從而調控其生長性能。因此，本試驗通過檢測肉仔雞血清生化指標、肝臟關鍵生長基因及骨骼肌雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)信號通路相關基因的表達，進一步探究蛋白酶的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取1日齡愛拔益加(AA)白羽肉仔雞324只，隨機分為3個組，每組6個重復，每個重復18只雞(公母各占1/2)。對照組飼喂基礎飼糧(前期粗蛋白質水平為23%，后期粗蛋白質水平為20%)；低蛋白質組(前期粗蛋白質水平為21%，后期粗蛋白質水平為18%)補充L-賴氨酸鹽酸鹽、DL-蛋氨酸和L-蘇氨酸達到AA肉仔雞飼養標準；低蛋白質加酶組在低蛋白質組飼糧基礎上添加500 mg/kg蛋白酶(蛋白酶由上海某生物技術有限公司提供，主要是從豬胰腺組織中提取的胰蛋白酶，酶活性為30 000 U/g)。飼糧組成及營養水平見表1。試驗期42 d。

表1 飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) %

續表1項目 Items1～21日齡 1 to 21 days of age對照組 Control group低蛋白質組 Low protein group22～42日齡 22 to 42 days of age對照組 Control group低蛋白質組 Low protein group蛋氨酸 Met0.500.510.410.41賴氨酸 Lys1.201.201.101.10蘇氨酸 Thr0.860.800.740.72

1.2 飼養管理

試驗雞采用3層立籠式養，1～7日齡每籠放18只雞，8～25日齡每籠9只，26～42日齡每籠6只。育雛期溫度維持在33～35 ℃，之后通過自由通風、風機和濕簾來降溫，直到22日齡以后溫度保持在24～26 ℃，相對濕度在65%～70%。試驗期間雞只自由采食、飲水，自然光照和人工補光相結合，飼養管理和免疫按常規程序進行。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長性能

分別于1、21和42日齡對肉仔雞進行稱重，試驗期間以重復為單位記錄每個階段的耗料量，計算每個階段雞只的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

平均日增重=(末重-初重)/
(試驗天數×雞只數)；
平均日采食量=總耗料量/
(試驗天數×雞只數)；
料重比=平均日采食量/平均日增重。

1.3.2 血清生化指標

試驗第43天，每重復挑選1只接近平均體重的雞，頸靜脈采血5 mL放入促凝管，3 500 r/min離心15 min分離血清，將分離的血清分裝到1.5 mL離心管中，放入-20 ℃保存備用。采用全自動血清生化分析儀(Beckman Coulter-AU5800，日本)測定血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性以及總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、尿素氮(UN)、尿酸(UA)和總膽固醇(T-CHO)含量。

1.3.3 肝臟關鍵生長基因及胸肌和腿肌TOR信號通路相關基因表達

1.4 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行多重比較。結果以平均值±標準差表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞生長性能的影響

由表3可知，與低蛋白質組相比，低蛋白質加酶組肉仔雞21和42日齡體重以及1～21日齡和1～42日齡平均日增重顯著提高(P<0.05)，1～21日齡料重比顯著降低(P<0.05)；并且，與對照組相比，低蛋白質加酶組肉仔雞1～21日齡平均日增重顯著提高(P<0.05)，1～21日齡料重比顯著降低(P<0.05)；低蛋白質組肉仔雞1～21日齡平均日采食量顯著低于對照組(P<0.05)，其他生長性能指標與對照組相比差異均不顯著(P>0.05)。

表3 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞生長性能的影響Table 3 Effects of protease supplementation in low protein diet on growth performance of broilers

2.2 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞胸肌率和腿肌率的影響

由表4可知，與低蛋白質組相比，低蛋白質加酶組肉仔雞胸肌率和腿肌率顯著提高(P<0.05)，且與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；低蛋白質組肉仔雞胸肌率和腿肌率與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

表4 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞胸肌率和腿肌率的影響Table 4 Effects of protease supplementation in low protein diet on chest muscle rate and leg muscle rate of broilers %

2.3 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞血清生化指標的影響

由表5可知，與低蛋白質組相比，低蛋白質加酶組肉仔雞血清總膽固醇含量顯著降低(P<0.05)，血清丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸轉移酶、堿性磷酸酶活性以及總蛋白、白蛋白、球蛋白和尿酸含量差異不顯著(P>0.05)；與對照組相比，低蛋白質加酶組肉仔雞血清尿素氮含量顯著降低(P<0.05)，低蛋白質組和低蛋白質加酶組血清尿酸含量均顯著降低(P<0.05)，低蛋白質組血清總膽固醇含量顯著提高(P<0.05)。

表5 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞血清生化指標的影響Table 5 Effects of protease supplementation in low protein diet on serum biochemical parameters of broilers

2.4 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞肝臟關鍵生長基因表達的影響

由圖1可知，與低蛋白質組相比，低蛋白質加酶組肉仔雞肝臟胰島素樣生長因子結合蛋白1(IGFBP1)基因表達量顯著降低(P<0.05)，肝臟胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、生長激素(GH)和生長激素受體(GHR)基因表達量顯著提高(P<0.05)，肝臟胰島素樣生長因子-Ⅰ受體(IGF-ⅠR)基因表達量差異不顯著(P>0.05)；低蛋白質加酶組肉仔雞肝臟IGFBP1基因表達量顯著低于對照組(P<0.05)，肝臟IGF-ⅠR基因表達量與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；低蛋白質組肉仔雞肝臟IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR、IGFBP1、GH和GHR基因表達量與對照組相比均沒有顯著差異(P>0.05)。

2.5 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞胸肌和腿肌TOR信號通路基因表達的影響

由圖2、圖3可知，與低蛋白質組相比，低蛋白質加酶組肉仔雞胸肌TOR、核糖體蛋白S6激酶β1(S6K1)及腿肌S6K1、真核翻譯起始因子4E結合蛋白1(4E-BP1)基因表達量顯著提高(P<0.05)，胸肌4E-BP1及腿肌TOR基因表達量差異不顯著(P>0.05)；與對照組相比，低蛋白質組和低蛋白質加酶組肉仔雞胸肌和腿肌TOR、S6K1和4E-BP1基因表達量均未見顯著差異(P>0.05)。

數據柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

圖2 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞胸肌TOR信號通路基因表達的影響Fig.2 Effects of protease supplementation in low protein diet on expression of TOR signaling pathway genes in chest muscle of broilers

圖3 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞腿肌TOR信號通路基因表達的影響Fig.3 Effects of protease supplementation in low protein diet on expression of TOR signaling pathway genes in leg muscle of broilers

3 討 論

3.1 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞生長性能的影響

飼糧中過高的蛋白質不能被動物完全消化，這不僅造成蛋白質原料的浪費，還會引起腸道健康問題。低蛋白質飼糧不影響甚至可改善肉雞生長性能。研究發現，肉雞飼糧粗蛋白質水平較NRC標準全期降低1～2個百分點，并通過添加賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸滿足肉仔雞營養需要，不僅不會對其生長性能產生不良影響，而且能顯著降低氮的排放，減少環境污染[5]。Waguespack等[6]研究發現，將飼糧粗蛋白質水平從22.0%降至19.5%，補充適量的合成氨基酸，能夠提高羅斯(Ross)708肉雞1～18日齡的生長性能，使其達到高蛋白質組水平。Abdel-Maksoud等[7]在1～18日齡科寶(Cobb)500肉雞上的研究也得到了相同的試驗結果。本試驗結果表明，飼糧粗蛋白質水平降低2個百分點，同時補充L-賴氨酸鹽酸鹽、DL-蛋氨酸和L-蘇氨酸達到肉仔雞飼養標準(低蛋白質組)，其生長性能能夠達到對照組水平。可能是補充的氨基酸水平滿足了機體生長發育的需要，因而不會損害其生長性能。近年來，蛋白酶作為一種高效的生物催化劑應用在畜禽飼料中，在提高飼糧蛋白質的利用率、改善生長性能等方面具有重要作用[8]。Wang等[9]研究表明，飼糧添加角蛋白酶可使肉仔雞1～21日齡的體增重得到提高，并且改善了1～42日齡的料重比。Yu等[10]研究證實，在玉米-豆粕型飼糧中添加蛋白酶可以提高肉雞的生長性能，改善飼料轉化率。本試驗結果表明，飼糧添加蛋白酶顯著提高了肉雞的體重和平均日增重，顯著降低了1～21日齡的料重比。可能是蛋白酶的使用促進了肉仔雞對飼糧中不可消化大分子營養物質的分解，供其吸收利用，從而改善生長性能。Inborr等[11]研究證明，大多由微生物發酵產生的酶制劑，為了滿足其自身結構的需求，而且隨著其分解物質的增加會反饋性刺激機體內消化酶的分泌，會提高對蛋白質的利用率，從而有效地改善動物生長性能。

3.2 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞血清生化指標的影響

血清總蛋白和白蛋白含量是表示體內蛋白質吸收與代謝情況的2個重要指標[12-13]。血清中的尿素氮含量與機體蛋白質和氨基酸的代謝呈明顯的負相關關系，可以明確反映出機體內蛋白質代謝和各種氨基酸平衡的狀況。血清尿酸是反映機體氮利用率的指標，其含量與氮的利用率呈負相關關系[14]。血清膽固醇可以反映機體對脂質代謝的狀況。天門冬氨酸轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶和堿性磷酸酶是衡量肝功能的主要指標。余紅心等[15]研究發現，飼糧粗蛋白質水平對血清中的各項生化指標均沒有顯著影響。田麗新等[16]在肉雞上的研究發現，分別將飼糧粗蛋白質水平降低1.5和3.0個百分比，血清中的總蛋白、白蛋白和球蛋白含量均沒有發生顯著變化，但是卻顯著降低了21日齡時血清的尿素氮含量。段曉翔等[17]研究表明，降低飼糧粗蛋白質水平可以不同程度地降低肉仔雞42日齡血清中的尿素氮和尿酸含量。盧晨[18]研究證實，飼糧添加適量的中性和酸性蛋白酶能夠不同程度地降低血清中的尿素氮含量，其中80 mg/kg中性蛋白酶和40 mg/kg酸性蛋白酶聯合添加顯著降低血清尿素氮含量。劉勝利等[19]研究表明，飼糧添加適量的蛋白酶(100、200和400 mg/kg)能夠降低肉雞血清中的尿酸含量。本試驗中，各組之間肉仔雞血清總蛋白、白蛋白含量及天門冬氨酸轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶和堿性磷酸酶活性均沒有顯著差異，但降低飼糧粗蛋白質水平會顯著降低血清中的尿酸含量，并且低蛋白質加酶組血清尿素氮含量顯著降低，低蛋白組血清尿素氮含量有降低的趨勢，但與對照組差異不顯著，這與之前的研究結果較為一致。這表明肉仔雞的肝臟沒有受到損害，對蛋白質和氨基酸的分解率低，氨基酸平衡狀況良好。但本試驗結果發現，降低飼糧粗蛋白質水平會使血清總膽固醇含量顯著升高，添加蛋白酶后血清總膽固醇含量與對照組相比無顯著差異。Jiang等[20]研究發現，當飼糧粗蛋白質水平從22%降低至16%時，北京鴨血漿總膽固醇含量會提高。可能是由于低蛋白質飼糧中理想的蛋白質比例降低了氮排泄所需的能量，使更多的能量沉積在脂肪組織中。王俊花等[21]在伊犁鵝的研究中也發現，飼糧分別添加0.2、0.3和0.4 g/kg的復合酶制劑(主要成分為蛋白酶、α-淀粉酶和纖維素酶等)，血清總膽固醇含量均有下降的趨勢，而且添加0.3 g/kg的復合酶制劑顯著降低血清總膽固醇含量。可能是因為酶制劑的使用降低了腸道內容物的黏滯性，促進了脂類物質的分解，從而降低了機體內總膽固醇含量[22-23]。

3.3 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞肝臟關鍵生長基因表達的影響

肝臟分泌的胰島素樣生長因子，也稱為生長介素，是生長激素軸的一種重要內分泌激素，在動物的生長發育過程中起著重要作用。飼糧中的營養物質能夠調節IGF-Ⅰ基因的表達，從而影響動物的生長、代謝。吳凡等[24]在中華鱉上的研究中發現，隨著飼糧中粗蛋白質含量的增加，會顯著提高肝臟IGF-Ⅰ基因的表達水平。這說明蛋白質作為重要的營養物質，顯著影響了肝臟中IGF-Ⅰ基因的表達，這與柳陽[25]在大西洋鮭上的研究結果一致。GH處于生長軸的中心環節，是整個生長軸上最重要的激素，是調控動物生長的關鍵因子，能夠刺激骨骼和軟骨的生長，促進動物機體的發育[26-27]。GH基因需要與靶器官上的相應受體結合，才可以產生生物學效應。因此，動物組織器官的發育和生長快慢，主要取決于靶細胞上GHR基因表達，組織中GHR的功能與含量直接影響了GH發揮其生理效應，從而影響動物的生長發育模式。飼糧的營養水平直接影響了動物生長軸相關激素的表達。丁玉華[28]研究了營養對生長基因的表達調控，結果表明飼喂低色氨酸飼糧的仔豬肝臟中GHR的mRNA表達量顯著降低。Radcliff等[29]研究發現，飼喂高營養飼糧組的犢牛肝臟中GHR和IGF-Ⅰ基因表達量顯著提高。姜洋洋等[30]研究了妊娠藏母羊飼糧蛋白質水平對初生羔羊機體內GH基因表達的影響，通過飼喂蛋白質水平分別為7.5%和13.5%的飼糧，結果表明，7.5%蛋白質組羔羊肝臟中GH基因表達量顯著低于13.5%蛋白質組。胰島素樣生長因子可以通過胰島素樣生長因子結合蛋白轉運至全身組織細胞，并與對應胰島素樣生長因子受體結合，促進組織細胞生長與分化，進而起到對動物生長發育的調控作用[31-33]。胰島素樣生長因子結合蛋白會抑制胰島素樣生長因子的活性，IGFBP1通過與IGF-ⅠR競爭性結合IGF-Ⅰ從而抑制IGF-Ⅰ的活性[34]。研究發現，在某些脅迫條件(如禁食、營養不良和蛋白質限飼)條件下，在轉錄水平上會誘導IGFBP1基因的高表達。Takenaka等[35]在小鼠上的試驗研究表明，在氨基酸不足的條件下，IGFBP1基因的表達量提高。同樣，在斑馬魚胚胎中IGFBP1的過表達會導致胚胎發育延緩[36]。這些研究均表明IGFBP1在機體的生長發育過程中具有重要作用。本試驗中，低蛋白質組肝臟中關鍵生長基因的表達量與對照組沒有顯著差異，說明調整氨基酸平衡保證了飼糧供給的氨基酸營養需要，而添加蛋白酶顯著提高了肉仔雞肝臟中IGF-Ⅰ、GH和GHR基因的表達量，顯著降低了肝臟中IGFBP1基因的表達量。關于蛋白酶對生長基因的表達還未見報道，可能是由于添加蛋白酶提高了肉仔雞的體重和平均日增重，從而提高了肝臟關鍵生長代謝基因的表達，這與生長性能結果相吻合。

3.4 低蛋白質飼糧添加蛋白酶對肉仔雞胸肌和腿肌TOR信號通路基因表達的影響

TOR參與調節肌肉蛋白質合成與降解的動態平衡，在骨骼肌蛋白質沉積起著關鍵作用[37]。TOR既是一種蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇相關蛋白激酶家族成員，也是一種重要的信號傳導分子，是調節細胞生長周期和生長信號的一個中心環點[38]，在蛋白質合成過程中也起著較為關鍵的作用。TOR可以與幾種蛋白質相互作用，形成在生物及功能上迥然不同的2種蛋白質復合物，即雷帕霉素靶蛋白復合物l(target of rapamycin complex 1,TORC1)與雷帕霉素靶蛋白復合物2(target of rapamycin complex 2,TORC2)。其中，TORC1對雷帕霉素敏感，參與營養物質、生長因子、能量應激、缺氧和機械應變等刺激產生響應，是一種關鍵的合成代謝細胞內信號轉導機制[39]。TORC1由TOR、TOR調控相關蛋白(regulatory-associated protein of TOR，Raptor)及G蛋白β亞基樣蛋白(G protein β-subunit-like protein，GβL)組成。TORC1最具特征的2個下游靶標是S6K1和4E-BP1。S6K1對蛋白質的合成具有正向調控作用。4E-BP1是mRNA 5′端帽結構結合蛋白——真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)的抑制因子。S6K1處于非磷酸化狀態時，與真核起始因子3(eukaryotic initiation factor,eIF3)高度親和，此時S6K1處于失活狀態，當TOR受到外部條件的刺激被激活以后，TOR與S6K1競爭結合eIF3，S6K1發生磷酸化并激活S6K1使之成為有活性的狀態，與S6核糖體有關的成分起作用后，將會磷酸化核糖體蛋白S6，使得mRNA的翻譯功能效率提高，特別是與蛋白質合成編碼相關蛋白的mRNA[40]。此外，非磷酸化形式的4E-BP1與eIF4E緊密相關，該蛋白和40S核糖體與mRNA鏈上的5′端帽結構mRNA的翻譯有關。這種結合抑制了eIF4E，但是磷酸化的4E-BP1將從eIF4E中釋放出來，從而使其他翻譯起始因子(如真核起始因子4G)能夠與eIF4E結合形成復合物，進而提高mRNA的翻譯起始效率，加速蛋白質合成[41]。研究發現，一些營養因子，特別是氨基酸，可以通過TOR信號通路激活TORC1的活性，調控組織蛋白質的合成，提高飼糧中蛋白質的利用效率[42]。Torrazza等[43]研究表明，在低蛋白質飼糧中添加亮氨酸激活了TOR信號通路，提高了下游信號分子S6K1和4E-BP1基因的表達水平，能夠達到高蛋白質組的效果。本試驗中，與對照組相比，低蛋白質組肉雞胸肌和腿肌TOR、S6K1和4E-BP1基因表達量差異不顯著，與上述研究結果相一致；而低蛋白酶加酶組肉雞胸肌或腿肌TOR、S6K1和4E-BP1基因表達量較低蛋白質組有所提高，說明蛋白酶的使用增加了蛋白質在骨骼肌中的沉積，這與胸肌率和腿肌率顯著提高的結果相符合。本試驗結果與Rayan等[44]在肉雞上的試驗結果較為一致，他們的研究表明，在肉雞飼糧中添加200 mg/kg復合蛋白酶制劑，可將胸肌率提高7.5%。杜紅方等[45]的研究也發現，在肉雞飼糧中添加500 g/t的復合酶制劑(含蛋白酶、木聚糖酶和纖維素酶等)對胸肌率、腿肌率均有改善的作用，可將胸肌率、腿肌率分別提高3.88%、6.57%。

4 結 論

① 低蛋白質飼糧添加500 mg/kg蛋白酶能夠提高肉仔雞的平均體重，降低1～21日齡料重比。

② 低蛋白質飼糧添加蛋白酶能夠提高肉仔雞肝臟關鍵生長基因IGF-Ⅰ的表達量，降低肝臟IGFBP1的表達量，并通過激活TOR信號通路，提高骨骼肌中TOR、S6K1及4E-BP1的表達量，從而促進蛋白質的合成，提高肉仔雞生長性能。