酵母培養物替代魚粉對大口黑鱸生長性能、血清生化指標和腸道形態結構的影響

卞宇豪 許曉瑩 段志鵬 孫中超 劉江英 李小勤 冷向軍*

(1.上海海洋大學水產與生命學院水產科學國家級教學示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學水產與生命學院農業部魚類營養與環境生態研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學水產與生命學院水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，上海 201306；4.上海源耀生物股份有限公司，上海 200000)

魚粉粗蛋白質含量高、氨基酸平衡、適口性好、未知促生長因子含量豐富，是肉食性魚類飼料中主要的蛋白質源。但是，由于水產養殖業的迅速發展，不良氣候的自然影響和過度捕撈的人為影響等因素，全球水產飼料對魚粉的需求量急劇增加，魚粉價格持續上漲，嚴重制約了水產養殖業的進一步發展。因此，節約魚粉的使用量并尋找合適的新型替代物成為飼料工業急需解決的問題。

酵母培養物是指在特定工藝條件控制下，由酵母菌在特定培養基經充分厭氧發酵后得到的微生物制品，主要由酵母細胞外代謝產物、經過發酵后變異的培養基和少量已無活性的酵母細胞所構成[1]。目前，有關酵母培養物在水產飼料中的應用研究，在異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[2]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[3]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)[4]和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[5-6]均有報道。酵母培養物在增強動物生長性能、提高動物機體免疫力、提高動物抗病力和對動物腸道健康具有積極作用[7]。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)是一種具有很高經濟價值的肉食性魚類，其肉質鮮美，無肌間刺，營養價值高，在中國已廣泛養殖。2019年全國大口黑鱸產量已達到47.8萬t[8]。大口黑鱸對飼料中蛋白質的營養需求較高，商業飼料中的魚粉含量一般高達40%～50%，因此，研究尋找適宜的新型蛋白質源替代魚粉具有極其重要的意義。目前，在大口黑鱸飼料中已報道過的替代魚粉的蛋白質源有豆粕[9]、發酵豆粕[10-11]、血粉[12]和羽毛粉[13]等，但尚未見酵母培養物在大口黑鱸飼料中的應用報道。故本試驗以大口黑鱸為研究對象，以酵母培養物替代不同比例魚粉，考察其對大口黑鱸生長性能、血清生化指標及腸道組織結構的影響，為開發大口黑鱸高效綠色環保飼料和酵母培養物在水產飼料中的合理應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與試驗飼料

根據大口黑鱸的營養需求[14]，配制魚粉含量為35%的基礎飼料(對照組)，用酵母培養物等蛋白質替代對照組飼料中5%、10%、15%的魚粉，共配制成4種等氮等脂的試驗飼料，其魚粉含量分別為35%、30%、25%和20%，記為FM-35(對照)、FM-30、FM-25和FM-20。飼料配制過程采用人工添加配料，飼料原料經超微粉碎機(800Y，永康市鉑歐五金制品有限公司)粉碎后，過60目篩。按飼料配方稱重，逐級混勻,加入適量的水，混勻后過10目篩，經制粒機(SLP-45，中國水產科學研究院漁業機械儀器研究所研制)制成直徑為2 mm的顆粒，50 ℃烘干至水分含量低于10%，密封后-20 ℃保存。試驗飼料組成及營養水平見表1。

表1 試驗飼料組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

續表1項目 Items飼料 DietsFM-35(對照 Control)FM-30FM-25FM-20魷魚膏 Squid visceral meal4.004.004.004.00礦物質預混料 Mineral premix2)2.502.502.502.50維生素預混料 Vitamin premix3)0.500.500.500.50氧化釔 Y2O30.050.050.050.05合計 Total100.00 100.00 100.00 100.00 營養水平 Nutrient levels4)水分 Moisture8.729.039.559.73粗蛋白質 CP43.2443.2143.3943.01粗脂肪 EE11.7711.6311.8611.67粗灰分 Ash11.0610.7210.509.98

所用酵母培養物由上海某生物股份有限公司生產，是以優質豆粕、葡萄糖、谷朊粉等為培養基底物，接種釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)，經深度發酵、升溫自溶、低溫干燥、超微粉碎所得到的發酵產品。其中，深度發酵的條件：53%發酵水分(w/w)發酵48 h，酵母接種后初始發酵菌總數：5×108CFU/g。升溫自溶后酵母破壁率90%以上。低溫干燥條件：物料溫度60～70 ℃，10 min。超微粉碎后物料細度：90%通過60目篩，100%通過40目篩。酵母培養物的粗蛋白質含量55.7%，粗脂肪含量1.6%，粗灰分含量6.5%，粗纖維含量4.6%，甘露聚糖含量2.2%，核苷酸含量2 014 μg/g，酵母接種量5×108CFU/g。

測定飼料氨基酸組成時，飼料樣品在110 ℃條件下用6 mol/L鹽酸水解24 h。用氨基酸自動分析儀(S-433D，德國)測定氨基酸含量。飼料及酵母培養物氨基酸組成見表2。

表2 飼料及酵母培養物氨基酸組成(干物質基礎)Table 2 Amino acid composition of diets and yeast culture (DM basis) %

1.2 試驗魚及飼養管理

試驗用大口黑鱸采購自浙江湖州鱸魚養殖場，以基礎飼料暫養馴化4周后，挑選體質優良、規格均勻、平均體質量為(21.2±0.1) g的大口黑鱸300尾進行養殖試驗，養殖條件為室內養殖，試驗共設置4個組，每組3個平行(桶)，每個塑料桶(直徑1.0 m，高1.0 m，水體體積550 L)隨機放置鱸魚25尾。養殖用水為循環水，每個桶每分鐘流量為10 L。養殖期間，采用近飽食投喂方式喂食，每天投喂飼料2次(08:00、16:00)，日投飼率為魚體重的2.0%～4.0%，并根據進食情況和天氣情況及時調整，各桶投飼量保持基本一致。晝夜充氣，采用虹吸方式吸走桶底糞便，每天吸污1～2次(養殖前期1次，后期2次)，每周換水2次，換水量為循環系統的1/3～1/4。養殖在自然光下進行，水源為曝氣處理后溶氧充足的自來水，水溫22～30 ℃，溶氧含量≥5.0 mg/L，pH 6.8～7.5，氨氮含量≤0.1 mg/L，亞硝酸鹽含量≤0.1 mg/L。養殖試驗于上海海洋大學濱海基地進行，養殖試驗共56 d。

1.3 樣品采集

養殖試驗開始時，取10尾鱸魚作為初始全魚樣本。養殖試驗結束后，停止投喂，魚體饑餓24 h，記錄每桶魚的數量和總重，統計采食量，計算初均重(IBW)、末均重(FBW)、存活率(SR)、增重率(WGR)、平均日采食量(ADFI)、飼料系數(FCR)。各桶隨機取3尾魚，用于全魚常規營養成分分析。另每桶隨機取6尾麻醉后的大口黑鱸測量體長、體重，用1 mL一次性注射器從尾靜脈抽血，3 000 r/min離心10 min，取上清液，保存于-80 ℃冰箱備用,用于檢測血清生化指標。抽完血后，立即將鱸魚解剖，稱量內臟重和肝臟重，計算肥滿度(CF)、臟體比(VSI)、肝體比(HSI)。從3尾抽過血的鱸魚中取腸道，按照文獻[16]的方法進行腸道分段，取其前腸，放入波恩試液中，用于制作腸道組織切片。

糞便收集從養殖試驗的第4周開始。每次喂食后1～2 h，用虹吸方法收集糞便，取包膜完整的糞便于-20 ℃冰箱中保存。待收集到足量糞便后，于105 ℃烘干，用于營養物質消化率分析。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生長指標與形體指標

相關計算公式如下：

SR(%)=100×末尾數/初尾數;
WGR(%)=100×[末均重(g)-初均重(g)]/
初均重(g);
FCR=投喂量/[末均重(g)-初均重(g)];
攝食量(FR，g)=[攝入飼料總重(g)×100]/
末尾數;
HSI(%)=100×肝臟重(g)/體重(g);
VSI(%)=100×內臟重(g)/體重(g);
CF(g/cm3)=100×體重(g)/
體長3(cm);
ADFI(g)=總攝食量(g)/
[末尾數×試驗天數(d)]。

1.4.2 飼料、糞便、全魚組成和營養物質消化率、沉積率

鱸魚及飼料樣品常規分析參考AOAC(2000)。其中，水分含量通過烘箱在105 ℃下烘干至恒重測定；粗蛋白質含量采用自動凱氏定氮儀(2 300-Auto-analyzer，Foss Tecator，瑞典)測定；粗脂肪含量采用氯仿甲醇法測定；粗灰分含量是在550 ℃馬福爐中灼燒12 h后測得。飼料和糞便中釔元素的分析采用等離子體原子發射光譜法(ICP)(Vista MPX，美國)。在此基礎上，分別計算干物質表觀消化率(ADDM)、粗蛋白質表觀消化率(ADCP)、蛋白質效率(PER)、蛋白質沉積率(PRR)、脂肪沉積率(LRR)，計算公式如下：

ADDM(%)=100×[1-飼料釔含量(%)/
糞便釔含量(%)];
ADCP(%)=100×{1-[飼料釔含量(%)×
糞便粗蛋白質含量(%)]/[糞便釔含量(%)×
飼料粗蛋白質含量(%)]};
PER=[末均重(g)-初均重(g)]/
攝食蛋白質量;
PRR(%)=100×[末均重(g)×末全魚粗蛋白質
含量(%)-初均重(g)×初全魚粗蛋白質
含量(%)]/[投喂量(g)×飼料粗蛋白質
含量(%)];
LRR(%)=100×[末均重(g)×末全魚粗脂肪
含量(%)-初均重(g)×初全魚粗脂肪含量
(%)]/[投喂量(g)×飼料粗脂肪含
量(%)]。

1.4.3 血清生化指標

血清白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)含量及谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)活性等血清生化指標使用上海哈靈生物科技有限公司生產的相應試劑盒，并通過自動生化分析儀(Chemray800，雷杜Rayto)測定。血清超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用黃嘌呤氧化酶法；過氧化氫酶(CAT)活性測定采用鉬酸銨法；總抗氧化能力(T-AOC)測定采用比色法；溶菌酶(LZM)活性測定采用比濁法。上述指標測定所用試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.5 腸道組織切片

前腸組織放入Bouin氏固定液中，24 h后，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(厚度為7 μm)(Leica RM2235 切片機，德國)，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腸絨毛形態特征并拍照(Nikon YS100顯微攝影系統)，用顯微測微尺測量絨毛高度、寬度和肌層厚度。

1.6 攻毒試驗

攻毒試驗采用嗜水氣單胞菌，由上海海洋大學國家水生動物病原庫提供。將原菌液加入液體LB培養基中過夜復性培養，再將復性后的菌種接種到脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板(用于致病性嗜水氣單胞菌的鑒別培養)，長出單菌落后，挑單一菌落到液體LB培養基培養12 h以上，放入離心機4 000 r/min離心5 min，棄上清，用滅菌生理鹽水稀釋成菌懸液。制備好的菌液用一次性注射器通過腹腔注射進魚體，從剛死的鱸魚肝臟取新菌，加至液體LB培養基，重復活化步驟，得到菌懸液。再通過7 d的預試驗，確定半致死濃度為1.6×108CFU/mL。養殖試驗結束后，每個桶隨機選10尾大小均勻的魚進行正式攻毒試驗，按照半致死濃度通過腹腔注射菌液0.2 mL/尾。試驗期間，每隔一段時間(攻毒后1、24、48、72、96 h)觀察魚的死亡情況并記錄累計死亡率(CM)。

CM(%)=100×累計死亡尾數/初始總尾數。

1.7 數據處理

數據以平均值±標準差(SD)表示，采用SPSS 24.0分析軟件進行ANOVA單因子方差分析和Duncan氏多重檢驗，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 生長性能和形體指標

由表3可知，經56 d養殖后，各試驗組鱸魚生長良好，SR均為100%。FM-30和FM-25組的FBW、WGR、FCR、ADFI與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，但FM-20組的FBW和WGR較其他3組顯著降低(P<0.05)，FCR顯著提高(P<0.05)。各組之間CF沒有顯著差異(P>0.05)。隨著魚粉替代水平的提高，HSI和VSI呈現下降趨勢，其中FM-25、FM-20組的HSI和FM-20組的VSI顯著低于對照組(P<0.05)。

表3 酵母培養物對大口黑鱸生長性能和形體指標的影響Table 3 Effects of yeast culture on growth performance and physical indexes of largemouth bass

2.2 全魚成分

由表4可知，各組間全魚水分、粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分含量均無顯著差異(P>0.05)。

表4 酵母培養物對大口黑鱸全魚成分的影響Table 4 Effects of yeast culture on whole-body composition of largemouth bass %

2.3 營養物質利用率

由表5可知，FM-30組的PER、PRR、LRR、ADDM和ADCP與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；FM-25組的PER、ADDM和ADCP較對照組顯著降低(P<0.05)，FM-20組的PER、PRR、LRR、ADDM和ADCP顯著低于對照組(P<0.05)。

表5 酵母培養物對大口黑鱸營養物質沉積率和表觀消化率的影響Table 5 Effects of yeast culture on retention and apparent digestibility ratios of nutrients of largemouth bass

2.4 血清生化指標

由表6可知，酵母培養物替代不同比例魚粉對鱸魚血清TP、ALB、GLO含量的影響不顯著(P>0.05)。血清ALT和AST活性出現先升高后降低的趨勢，ALT活性在FM-25組達到最大，顯著高于對照組(P<0.05)。各替代組血清中T-AOC、SOD及CAT活性與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。血清LZM活性隨著魚粉替代水平的提高總體呈現上升趨勢，FM-20組的血清LZM活性較對照組顯著提高(P<0.05)。

表6 酵母培養物對大口黑鱸血清生化指標的影響Table 6 Effects of yeast culture on biochemical indices in serum of largemouth bass

2.5 腸道形態結構

由表7可知，各酵母培養物組的絨毛寬度顯著低于對照組(P<0.05)，FM-25組與FM-30組的絨毛高度顯著高于對照組(P<0.05)。隨著魚粉替代水平的提高，肌層厚度呈現先上升后降低的趨勢，其中FM-25組的肌層厚度最大，且顯著高于對照組(P<0.05)。各組的前腸組織切片見圖1。

表7 酵母培養物對大口黑鱸腸道形態結構的影響Table 7 Effects of yeast culture on intestinal morphology of largemouth bass μm

1～4:對照(FM-35)、FM-30、FM-25和FM-20組的前腸組織;MT:肌層厚度；VH:絨毛高度；VW:絨毛寬度。

3 討 論

3.1 酵母培養物對大口黑鱸生長性能和營養物質利用的影響

酵母培養物是在豆粕等培養基中，加入酵母菌等微生物，在特定工藝條件下發酵后干燥而得的混合物，富含蛋白質、小肽、氨基酸、維生素、寡糖、消化酶和芳香類物質，具有良好的適口性和促生長作用,可提高養殖動物的采食量和改善生產性能。酵母培養物還含有許多未知生長因子,可提高動物生產性能[15]。

李軍濤等[3]將酒糟酵母培養物按8%～16%的比例加入基礎飼料(占混合物的比例為8%～16%)，顯著提升了草魚的生長速度。在桂良超等[17]的研究中，用酵母培養物替代基礎飼料中的魚粉(含量25%)，當替代比例小于20%時，不會影響凡納濱對蝦的生長性能。在本試驗中，基礎飼料含魚粉35%，用酵母培養物替代10%的魚粉(魚粉降為25%)，對體增重和飼料系數沒有產生顯著影響，但當酵母培養物替代15%的魚粉時，大口黑鱸的增重率顯著降低，飼料系數顯著增加。從氨基酸的組成來看，酵母培養物中的賴氨酸等必需氨基酸的含量較低，隨著魚粉替代比例的增加，必需氨基酸的缺乏則表現得較為明顯；但在替代魚粉比例較低的時候，其中有機酸、核苷酸等活性成分的誘食、促消化及促生長作用彌補了必需氨基酸的不足，故對生長沒有產生顯著影響。

在本試驗中，酵母培養物替代5%的魚粉時，對干物質和粗蛋白質表觀消化率沒有產生顯著影響，但當酵母培養物替代更高比例的魚粉時，干物質和粗蛋白質表觀消化率顯著降低。這可能與酵母培養物中的主要原料是豆粕等植物性原料有關。盡管經過了高度發酵，與魚粉相比，其消化率仍較低。今后，需要進一步解決植物性蛋白質原料營養物質利用率低的問題。

3.2 酵母培養物對大口黑鱸血清生化指標的影響

血液生化指標能反映魚類的生理和健康狀況[18]。血清TP是反映機體蛋白質代謝狀況的重要指標，血清TP含量的增加可以促進機體蛋白質沉積，促進生長。血清ALB主要反映機體營養能力，血清GLO主要與機體免疫能力有關。血清ALT和AST是動物機體分布最廣泛，也是最重要的轉氨酶，主要反映肝臟的健康狀況。當血清中ALT和AST活性大幅升高時，反映出肝臟受到損傷[18]。在本試驗中，各替代組鱸魚血清中TP、ALB及 GLO含量均呈現升高趨勢，FM-25組血清ALT活性顯著高于對照組。由于本試驗中沒有發現明顯的綠肝、花肝等現象，FM-25組的生長性能良好，其血清ALT活性的升高是否意味著肝臟的損傷，或者意味著代謝的增加，需要進一步的研究。 LZM具有溶菌活性，作為非特異性生物防御因子能對某些細菌發揮抵抗作用，可誘導其他免疫因子的合成和分泌[19]。在本試驗中，隨著酵母培養物替代魚粉比例的上升，血清中 LZM活性呈現升高趨勢，其中FM-20組顯著高于對照組。這說明在飼料中適量添加酵母培養物可以提高水產動物的機體免疫力，類似結果在桂良超等[17]對凡納濱對蝦的研究和程鑫等[20]對黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)的研究中也有報道。

魚類機體新陳代謝產生的過量氧自由基，能通過其體內的酶系和非酶系抗氧化系統進行清除，維持機體內穩態[21]。SOD是生物體內清除氧自由基的首要物質；CAT清除過氧化氫，使細胞免于遭受過氧化氫的毒害；血清T-AOC則與機體的健康狀況密切相關。在本試驗中，各替代組血清中SOD活性、T-AOC、CAT活性與對照組相比，均差異不顯著。這說明飼料蛋白質源的變化并未造成大口黑鱸機體的氧化損傷。

酵母培養物中富含β-葡聚糖、甘露聚糖、功能性多肽、核苷酸等，均有提高動物免疫水平的作用。β-葡聚糖能刺激動物體產生對機體免疫功能起關鍵作用的巨嗜細胞，可清除體內損傷、衰亡的細胞和侵入體內的病原微生物。甘露聚糖通過提高免疫球蛋白含量，改善巨噬細胞活性等提高機體免疫力[22]。在不同的酵母培養物中，上述活性成分的種類和含量存在較大差異。酵母培養物對機體抗氧化能力和非特異性免疫的影響，在很大程度上取決于酵母培養物的用量和種類。

3.3 酵母培養物對大口黑鱸腸道形態結構的影響

腸道是魚類機體消化和吸收營養物質的主要器官，其健康狀況影響著魚類的正常生長發育。在草魚飼料中添加50 mg/kg的酵母培養物(水解物)能夠顯著促進草魚腸道的發育，增加其絨毛高度[23]。邱燕等[24]發現，在飼料中添加1 000 mg/kg酵母培養物能夠通過改善草魚腸道黏膜形態，促進草魚對飼料的吸收利用，從而促進草魚生長。這2種酵母培養物實際上是酵母水解物及其代謝物，而本試驗所用的酵母培養物是在豆粕等培養基中加入酵母菌發酵而成，在功能性成分方面，可能具有類似的組成。本試驗結果表明，各替代組鱸魚的絨毛寬度均顯著低于對照組，隨著酵母培養物替代魚粉比例的上升，腸道絨毛高度及肌層厚度呈現先上升后下降的趨勢，且均在FM-25組達到最高，這表明酵母培養物可以在一定程度上改善鱸魚腸道形態結構，這可能與酵母培養物中含有甘露寡糖和核苷酸有關。甘露寡糖能通過促進黏液的分泌,保護腸道絨毛免受破壞,從而提高腸道絨毛的整齊度、完整性及高度。甘露寡糖還能夠促進極性脂質的再酰化和合成,脂質的利用率提高后,用于生長和細胞膜合成的能量增多,這也是甘露寡糖提高腸道絨毛完整性的原因之一[25]。這在金頭鱒(Sparusaurata)[26]、歐洲鱸魚(Dicentrarchuslabrax)[27]和異育銀鯽[28]的研究中得以證明。另外，在團頭魴[29]和大西洋鮭(Salmosalar)[30]的研究中，核苷酸可以改善腸道絨毛結構，從而促進腸道健康。這可能源于核酸經消化酶的作用后，逐步分解成小分子核苷、堿基等，使腸道黏膜核酸和蛋白質含量增加，從而促進腸絨毛的生長和腸壁厚度的增加，并有利于腸道微生物菌群的快速繁殖[31]。

4 結 論

本試驗研究結果表明，在魚粉含量為350 g/kg的大口黑鱸飼料中，可用酵母培養物替代100 g/kg的魚粉用量，不會對大口黑鱸的生長性能、飼料利用、腸道健康、抗氧化能力和非特異性免疫產生不利影響。