補喂胍基乙酸對伊犁馬運動性能、糖代謝以及抗氧化能力的影響

劉 律 李曉斌 馬 艷 楊 昊 張文杰 魯 豪 衛鑫嵐 高俊潔 歐陽文 楊開倫*

(1.新疆農業大學動物科學學院，新疆肉乳用草食動物營養重點實驗室，烏魯木齊 830052；2.新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣種馬場，昭蘇 835000)

運動馬比賽成績優劣依賴于馬匹多種器官機能和功能的協調配合及高效運行，運動系統在馬匹完成高強度訓練和競賽中具有重要作用[1]。馬匹骨骼肌的能量貯備和供能效率對速度賽馬具有重要意義[2]。胍基乙酸(guanidineacetic acid，GAA)又稱為N-咪基甘氨酸(N-amidinoglycine)，在動物體內由甘氨酸和L-精氨酸合成，甲基化后形成肌酸(creatine，Cr)[3]。GAA可作為肌酸激酶(creatine kinase，CK)和補充磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)的底物，提高肌肉中磷酸肌酸貯備量及轉化為ATP的效率，保持肌肉高強度劇烈運動[4]；可通過節約精氨酸來促進蛋白質和一氧化氮(NO)的合成，進而提高肌肉發達能力，舒張血管[5]；可通過激活一些抗氧化酶的活性和增加總抗氧化能力來提高細胞抗氧化水平[6]。Ostojic等[7]研究發現年輕個體中補充1.2～4.8 g/d GAA 6周后，可以提高志愿者手握力、肌肉耐力，進而提高運動能力。有研究表明，飼糧中添加38 g/d的GAA，飼喂38 d后可提高速步馬的運動成績,提高賽后血漿中過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力[8]。Ale等[9]在研究GAA對肉雞能量代謝的影響時發現，飼糧中添加1.2 g/kg的GAA，飼喂35 d后可以促進肌肉的能量代謝，而且影響肌肉中肌酸總量、磷酸肌酸及ATP的含量，從而提高能量利用率。伊犁馬是我國自主育成的馬品種，主要分布于新疆伊犁地區，具有良好的運動性能，在2019中國“絲綢之路杯”比賽中，3 600和8 000 m速度賽冠軍均為伊犁馬，展現出超凡的速度和耐力。但伊犁馬目前存在激烈運動競賽后易疲乏、恢復慢等問題，嚴重制約了伊犁馬優異運動性能的發揮。因此，本試驗選用速度賽用伊犁馬為研究對象，探究飼糧中添加不同劑量的GAA對伊犁馬2 000 m速度賽成績、運動性能、糖代謝以及抗氧化能力的影響，為GAA在運動馬飼糧中的應用提供科學參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

本試驗于2020年5月17日至2020年7月2日在新疆維吾爾自治區伊犁哈薩克自治州昭蘇種馬場進行。

1.2 試驗設計及飼糧組成

表1 試驗飼糧組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diet (DM basis) %

1.3 飼養管理

試驗馬匹單廄飼養管理，自由飲水。補喂的GAA與精料補充料分為2份裝入封口袋，每日分2次飼喂，分別在08:00和20:00；青干草每日分3次添喂，分別在07:30、13:30和19:30。飼喂時先粗后精，先采食粗飼料1 kg，再補給精料補充料，待精料補充料采食完畢后，繼續添喂粗飼料。每天按時打掃馬廄，清除糞便和墊草，并更換為干燥柔軟的墊草。

1.4 訓練方案及場地

試驗馬匹每天進行1次速度訓練，馬匹訓練時間安排在11:00—13:00或者17:30—19:30。首先進行熱身訓練，騎手騎乘試驗馬先在草道上慢步10 min，隨即進入沙道，進行10 min快步訓練，然后15 min慢跳訓練，最后停止訓練，牽遛5～10 min，直至馬匹呼吸平穩。訓練場地為新疆昭蘇種馬場伊犁馬測試調訓中心，賽道由橢圓形沙道和草道組成。內部沙道由細沙構成，深度40 cm，底部為土基，道寬21 m，周長為800 m；外部草道由天然的牧草形成，寬20 m，周長為1 000 m。

1.5 樣品采集及指標測定

1.5.1 平均速度測定

在試驗第0天(正試期開始前)和試驗第47天在新疆昭蘇種馬場伊犁馬測試調訓中心進行2 000 m速度賽，用秒表記錄每匹馬的比賽用時，用以下公式計算平均速度、平均每千米耗時、平均耗時減少以及成績提高幅度。

平均速度(m/s)=2 000(m)/比賽用時(s)；
平均每千米耗時(s)=試驗
第47天比賽用時(s)/2；
平均耗時減少(s)=試驗第0天比賽用時(s)-
試驗第47天比賽用時(s)；
成績提高幅度(%)=[平均耗時減少(s)/
試驗第0天比賽用時(s)]×100。

1.5.2 心率和呼吸頻率測定

在試驗第47天進行2 000 m速度賽，用脈搏儀記錄每匹馬賽前2 h(備好鞍前)、賽后即刻以及賽后2 h的心率，同時測定呼吸頻率。

1.5.3 血漿生化指標測定

于試驗第47天進行2 000 m速度賽的賽前2 h、賽后即刻、賽后2 h使用5 mL肝素鈉抗凝管和4 mL氟化鈉抗凝管于馬匹頸靜脈采集血液各1管，以3 500 r/min離心10 min，收集血漿，分裝，-20 ℃冷凍保存。

血漿送至北京華英生物技術研究所測定血漿生化指標。胰島素(INS)、胰高血糖素(Gc)含量采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法測定；葡萄糖(GLU)、乳酸(LD)、丙二醛(MDA)含量，肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活性及總抗氧化能力(T-AOC)采用比色法測定。

1.5.4 尿液肌酸代謝物含量測定

于試驗第47天，實時跟蹤監測馬匹賽后狀態，使用自制移動收尿裝置，收集試驗馬匹賽后尿樣，將尿液充分搖勻后，收集樣品50 mL存入凍存管，-20 ℃冷凍保存。

馬匹血漿及尿液中GAA、肌酸、肌酐含量在新疆農業大學動物科學學院動物營養與飼料科學實驗室利用高效液相色譜法測定[12]。取待檢測血漿樣本200 μL置于EP管中，加入400 μL乙腈，渦旋混勻，靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，取100 μL上清用200 μL磷酸溶液(2 mmol/L)稀釋，渦旋混勻，取20 μL進樣，進行高效液相色譜分析。處理后的樣品經IC YS-50弱酸性陽離子交換柱分離，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，用紫外檢測器于210 nm波長處進行檢測。

1.6 數據處理與分析

試驗數據均采用Excel 2010進行初步整理，SPSS 19.0統計軟件的ANOVA程序進行單因素方差分析，差異顯著則用Duncan氏法進行多重比較，采用正交多項式對比，檢驗血漿和尿液中肌酸代謝物、糖代謝及抗氧化指標變化的線性和二次效應。結果以“平均值±標準差”(mean±SD)表示，以0.05≤P<0.10作為有顯著趨勢，P<0.05為差異顯著水平，P<0.01為差異極顯著水平。

2 結 果

2.1 補喂GAA對伊犁馬運動性能的影響

2.1.1 補喂GAA對伊犁馬2 000 m速度賽成績的影響

結果見表2，與CON組相比，各試驗組試驗初始和試驗第47天時2 000 m速度賽平均速度、平均每千米耗時均無顯著差異(P>0.05)；與試驗初始相比，試驗第47天時，CON組、試驗組2 000 m速度賽的平均速度均有所提高，成績提高幅度呈現二次顯著性變化，其中25 GAA組、50 GAA組以及75 GAA組成績提高幅度分別為5.23%、6.68%、2.70%，各試驗組均顯著高于CON組(P<0.05)。

表2 補喂GAA對伊犁馬2 000 m速度賽成績的影響Table 2 Effects of supplementary feeding GAA on performance of 2 000 m speed race of Yili horses (n=5)

2.1.2 補喂GAA對伊犁馬2 000 m速度賽賽前、賽后即刻及賽后呼吸心率的影響

結果見表3，各組馬匹賽前2 h生理狀態穩定，呼吸和心率差異均不顯著(P>0.05)。與CON組相比，各試驗組馬匹賽后即刻呼吸、心率差異均不顯著(P>0.05)；賽后2 h時，各組馬匹呼吸心率恢復到正常水平，各組間差異不顯著(P>0.05)。

表3 補喂GAA對伊犁馬2 000 m速度賽賽前、賽后即刻及賽后呼吸心率的影響Table 3 Effects of supplementary feeding GAA on respiratory heart rate before, immediately and after 2 000 m speed race of Yili horses (n=5)

2.2 補喂GAA對伊犁馬賽前、賽后即刻及賽后肌酸代謝物含量的影響

2.2.1 補喂GAA對伊犁馬賽前、賽后即刻及賽后血漿肌酸代謝物含量的影響

結果見表4，各試驗組賽前2 h血漿GAA含量與CON組相比均無顯著差異(P>0.05)；50 GAA組賽后即刻血漿GAA含量顯著高于CON組(P<0.05)；75 GAA組賽后2 h血漿GAA含量顯著低于CON組(P<0.05)；各試驗組賽后2 h血漿肌酸含量與CON組相比，均無顯著差異(P>0.05)；25 GAA組賽前2 h血漿肌酸含量顯著低于CON組(P<0.05)；50 GAA組賽后即刻血漿肌酸含量顯著高于CON組(P<0.05)。與CON組相比，各試驗組賽前2 h、賽后2 h血漿肌酐含量均無顯著差異(P>0.05)；50 GAA組賽后即刻血漿肌酐含量顯著高于CON組(P<0.05)。賽前2 h和賽后即刻肌酸激酶活性在總體、線性和二次效應上均呈現顯著性變化，75 GAA組賽前2 h、賽后2 h的血漿肌酸激酶活性最高，極顯著高于25 GAA組(P<0.01)；50 GAA組、75 GAA組賽后即刻各試驗組血漿肌酸激酶活性極顯著高于CON組(P<0.01)，同時50 GAA組極顯著高于75 GAA組(P<0.01)。

表4 補喂GAA對伊犁馬2 000 m速度賽賽前、賽后即刻及賽后血漿肌酸代謝物含量的影響Table 4 Effects of supplementary feeding GAA on plasma creatine metabolites content before, immediately and after 2 000 m speed race of Yili horses (n=5)

2.2.2 補喂GAA對伊犁馬賽后尿液肌酸代謝物排出量的影響

結果見表5，GAA、肌酸和肌酐排出量在總體、線性和二次效應上均呈現極顯著性變化，25 GAA組、75 GAA組賽后尿的GAA排出量均極顯著高于CON組(P<0.01)；25 GAA組、50 GAA組賽后尿的肌酸排出量均極顯著高于CON組(P<0.01)；各試驗組賽后尿的肌酐排出量均極顯著高于CON組(P<0.01)。

表5 補喂GAA對伊犁馬2 000 m速度賽賽后尿液肌酸代謝物排出量的影響Table 5 Effects of supplementary feeding GAA on urinary creatine metabolite excretion after 2 000 m speed race of Yili horses (n=5)

2.3 補喂GAA對伊犁馬賽前、賽后即刻及賽后糖代謝指標的影響

結果見表6，賽后即刻、賽后2 h血漿胰高血糖素含量在總體和線性效應上呈現極顯著性變化，75 GAA組賽后即刻和賽后2 h的胰高血糖素含量極顯著低于CON組(P<0.01)，50 GAA組賽后即刻和賽后2 h的胰高血糖素含量極顯著低于CON組(P<0.01)；賽前2h、賽后即刻和賽后2 h血漿胰島素含量在總體和線性效應上呈現極顯著性變化，與CON組相比，各試驗組賽前2 h、賽后即刻和賽后2 h的胰島素含量均極顯著高于CON組(P<0.01)；賽后即刻、賽后2 h血漿葡萄糖含量在總體和線性效應上呈現極顯著性變化，各試驗組賽前2 h葡萄糖含量均顯著高于CON組(P<0.05)，賽后即刻和賽后2 h葡萄糖含量均極顯著高于CON組(P<0.01)；賽前2 h、賽后2 h血漿乳酸含量在總體、線性和二次效應上均呈現極顯著性變化，與CON組相比，各試驗組賽前2 h、賽后即刻和賽后2 h的乳酸含量均極顯著低于CON組(P<0.01)。

表6 補喂GAA對伊犁馬2 000 m速度賽賽前、賽后即刻及賽后糖代謝指標的影響Table 6 Effects of supplementary feeding GAA on glucose metabolism indexes before, immediately and after 2 000 m speed race of Yili horses (n=5)

2.4 補喂GAA對伊犁馬賽前、賽后即刻及賽后抗氧化能力的影響

結果見表7，賽前2 h、賽后即刻、賽后2 h血漿谷胱甘肽過氧化物酶活性在總體和二次效應上呈現極顯著性變化，各試驗組賽前2 h和賽后2 h血漿谷胱甘肽過氧化物酶活性均顯著高于CON組(P<0.05)，25 GAA組、50 GAA組賽后即刻血漿谷胱甘肽過氧化物酶活性極顯著高于CON組(P<0.01)；賽前2 h、賽后2 h血漿超氧化物歧化酶活性在總體、線性和二次效應上均呈現極顯著性變化，與CON組相比，各試驗組賽前2 h和賽后2 h血漿超氧化物歧化酶活性均顯著高于CON組(P<0.05)，25 GAA組、50 GAA組賽后即刻血漿超氧化物歧化酶活性極顯著高于CON組(P<0.01)；各組馬匹賽前2 h、賽后即刻血漿過氧化氫酶活性均無顯著差異(P>0.05)，各試驗組賽后2 h過氧化氫酶活性均極顯著高于CON組(P<0.01)；賽后2 h血漿總抗氧化能力在總體、線性和二次效應上均呈現極顯著性變化，各試驗組賽前2 h和賽后2 h血漿總抗氧化能力均顯著高于CON組(P<0.05)，50 GAA組賽后即刻血漿總抗氧化能力極顯著高于CON組(P<0.01)；血漿丙二醛含量變化趨勢相反，50 GAA組賽后即刻及賽后2 h血漿丙二醛含量極顯著低于CON組(P<0.01)。

表7 補喂GAA對伊犁馬2 000 m速度賽賽前、賽后即刻及賽后抗氧化能力的影響Table 7 Effects of supplementary feeding GAA on antioxidant capacity before, immediately and after 2 000 m speed race of Yili horses (n=5)

3 討 論

3.1 補喂GAA對運動馬運動性能的影響

在肌肉活動急需能量的情況下，細胞內的磷酸肌酸很容易將磷酸基團傳遞給ADP生成ATP和肌酸；運動后的恢復期，細胞內積累的肌酸又可以轉化成磷酸肌酸在肌肉中進行貯存[13]。肌酸和磷酸肌酸作為骨骼肌能量的儲存物質，可能是決定運動馬運動性能的關鍵物質，GAA作為合成肌酸和磷酸肌酸的中間前體物質，對骨骼肌中的能量供應起著重要的調節作用。

本試驗中，各試驗組成績提高幅度均顯著高于CON組，50 GAA組在試驗第47天，2 000 m速度賽比賽成績比CON組縮短了5.16%，比試驗初始縮短了6.68%，說明補喂GAA能夠改善伊犁馬的運動性能。這與Ostojic等[7]在人體試驗中得出的補充1.2～4.8 g/d的GAA 6周后，可以提高肢體的肌肉耐力，提高運動能力的結果相一致。補喂GAA能夠提高運動機體的運動水平可能與增加肌肉中肌酸、磷酸肌酸的儲備量有關。研究顯示，GAA不僅能增加骨骼肌中肌酸的貯存量，并可促進高強度運動導致肌酸減少后細胞生物能的恢復[14]。在育肥豬試驗中發現，添加600 mg/kg GAA可以影響雜交仔豬肌肉中肌酸總量、磷酸肌酸及ATP的含量，使肌肉有足夠的能量收縮，從而提高能量利用率[14]。

3.2 補喂GAA對運動馬賽前、賽后即刻及賽后肌酸代謝物含量的影響

GAA由甘氨酸和L-精氨酸合成，通過血液循環被轉運至肝臟，經載體蛋白轉運進入肝臟細胞合成肌酸，釋放進入血液循環，然后經肌酸轉運蛋白(CreaT)將肌酸轉運進入肌纖維和其他組織中[14]。肌酸通過肌酸轉運蛋白進入骨骼肌細胞后，在肌肉組織中被磷酸化形成磷酸肌酸[15]，參與機體反應后，代謝為肌酸酐，經尿液排出體外。

在本試驗中，補喂GAA顯著提高了50 GAA組馬匹賽后即刻血漿GAA、肌酸、肌酐含量以及賽后尿中肌酸、肌酐的排出量，極顯著提高了25 GAA組、75 GAA組賽后尿液中GAA和肌酐的排出量。Mcbreairty等[16]研究發現給3月齡仔豬補喂157 mg/kg GAA 18 d，可提高仔豬肝臟和肌肉中肌酸含量。Ardalan等[17-18]發現在牛瘤胃后補充10～30 g/d GAA 30 d，可增加血漿GAA、肌酐含量，提高尿中GAA、肌酸含量，增加牛機體的肌酸供應，這與本試驗研究結果一致。機體在運動過程中需要消耗大量的能量，肌酸儲備量的增加，可加強肌酸和磷酸肌酸之間的轉化，進而為機體提供即時可用的能量。本試驗中，賽后即刻50 GAA組的血漿GAA、肌酸、肌酐含量均高于其他各組。這與Tachikawa等[19]體外培養的非洲爪蟾細胞對GAA的吸收呈現飽和效應，且GAA、肌酸均可作為細胞攝取GAA的抑制劑結果相一致。這可能是由于肌酸和GAA在細胞內共用一個CreaT轉運載體，肌酸的大量產生會對GAA的轉運產生抑制，同時過量的GAA也會對轉運產生自身抑制，降低機體對GAA的轉運吸收。

肌酸激酶是將肌酸轉化為磷酸肌酸的催化酶，機體運動時，ATP供能的水平下降不能滿足機體需要，磷酸肌酸可脫掉1個磷酸根，迅速與ADP合成ATP，進而參與機體的能量代謝[20-21]。本試驗中，50 GAA組、75 GAA組賽后即刻各試驗組血漿肌酸激酶活性極顯著高于CON組。Aziza等[22]給尼羅羅非魚補喂不同水平GAA(0.06%、0.12%、0.18%)，結果表明，各GAA組血清肌酸激酶活性、膽固醇含量均顯著高于對照組。李潔蕾[14]選用保育豬為試驗對象，隨機分為2組，研究表明補喂600 mg/kg GAA可極顯著提高飼喂21 d后保育豬血漿肌酸激酶活性。即試驗組肌酸激酶的高活性可在運動中為運動馬機體提供大量可即時供能的磷酸肌酸，對運動馬的運動性能有一定的積極作用。

3.3 補喂GAA對運動馬2 000 m速度賽賽前、賽后即刻及賽后糖代謝的影響

動物體內激素含量受多種因素影響，如運動會導致胰島素、胰高血糖素含量發生改變。胰島素在代謝調節中是一種作用較強的激素，能夠全面促進機體的合成代謝[23-24]。在本試驗中，補喂GAA極顯著提高了伊犁馬2 000 m速度賽賽前、賽后即刻及賽后血漿胰島素含量，降低了血漿胰高血糖素、葡萄糖和乳酸的含量。Marco等[25]最早在動物試驗中研究發現，體外注射GAA及胍基衍生物，能夠刺激大鼠的胰腺分泌胰島素，并且胍基團可是刺激胰島素分泌的一個重要原因。GAA刺激胰島素分泌的具體機制可能是由于GAA分子的極性能影響胰島細胞膜去極化，并通過蛋白激酶A和C增強靶細胞膜表面胰島素受體的活性，從而激活胰島素信號通路[26]。胰島素的生理功能主要表現為降低血糖含量，因此，外源性添加GAA能夠降低血漿中的葡萄糖含量，從而維持血糖穩態。在保育豬的試驗中，補喂600 mg/kg GAA 21 d后，發現補喂GAA可提高保育豬的血漿果糖-6-磷酸激酶、丙酮酸激酶、異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-輔酶Q還原酶、三磷酸腺苷合成酶活性，通過提高糖代謝和呼吸鏈相關酶的活性來增加ATP的合成，進而影響能量代謝[14]。孫正武[27]在探討磷酸肌酸對脂多糖(LPS)誘導的人靜脈細胞(HUVECs)及其細胞線粒體氧化磷酸化途徑的調節作用時發現，磷酸肌酸對以琥珀酸為底物的呼吸控制率和磷氧比值的改善程度大于以蘋果酸和谷氨酸為底物的情況，并且磷酸肌酸能夠增強細胞線粒體內磷酸激酶的活性，穩定細胞整體能量代謝。

3.4 補喂GAA對運動馬2 000 m速度賽賽前、賽后即刻及賽后抗氧化能力的影響

GAA作為超氧化劑能夠從它的共軛堿提供1個電子生成超氧陰離子-氧自由基，從而產生活性氧[28]。其代謝物肌酸是溫和的直接抗氧化劑(自由基清除劑)，可通過直接清除細胞內的活性氧特別是羧基以及活性氮來保護細胞，且肌酸激活肌酸激酶，通過ADP再循環機制消耗自由基，從而發揮抗氧化作用[29]。磷酸肌酸可以抑制氧化應激反應增強抗氧化酶系統功能。生理狀態下，體內自由基的產生與消除維持動態平衡。在應激情況下，自由基大量產生，當超過抗氧化防御系統的能力時，就會引起自由基的堆積，產生氧化損傷，動物通過抗氧化系統及時清除體內過多的自由基維持機體的自由基平衡[27]。

在本試驗中，補喂GAA均顯著提高了運動馬血漿的總抗氧化能力，血漿超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性，顯著降低了50 GAA組、75 GAA組血漿丙二醛含量。聞愛友等[30]研究發現在28日齡斷乳仔豬飼糧中添加150～450 mg/kg GAA可以提高動物血清中總抗氧化能力以及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性，并且降低血清丙二醛含量。Wang等[31]學者發現，在育肥豬飼糧中添加2.0 g/kg GAA，補喂54 d后顯著提高了育肥豬肌肉超氧化物歧化酶活性、總抗氧化能力和血液總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等抗氧化酶活性，極顯著降低了肌肉和血液丙二醛含量。Aziza等[22]學者給180尾尼羅羅非魚補喂不同水平GAA，結果表明，0.12%組和0.18%組血清丙二醛含量顯著降低，血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性和一氧化氮含量均顯著升高。這與本試驗研究結果相一致。此外，GAA是體內合成肌酸的前體物質，添加外源性GAA可有效增加機體肌酸、磷酸肌酸的含量，同時，補喂GAA可能節省了體內從頭合成肌酸的原料，增加細胞內精氨酸的含量，而精氨酸具有較強的抗氧化功效[32]。綜上所述，外源補喂GAA可以提高運動馬機體的抗氧化能力。

4 結 論

在本試驗條件下，補喂25～75 mg/kg GAA提高了伊犁馬血漿肌酸代謝物含量、肌酸激酶活性、賽后肌酸代謝物排出量以及機體抗氧化能力，促進了運動馬機體糖代謝對運動的供能，提高了伊犁馬2 000 m速度賽的運動成績，每匹馬補喂50 mg/kg時效果最佳。