不同添加量枸杞副產物對檸條錦雞兒發酵特性及微生物多樣性的影響

牟怡曉 張 歡 馬聰慧 張桂杰*

(1.寧夏大學農學院動物科學系，銀川 750021；2.寧夏草牧業工程技術研究中心，銀川 750021)

抗生素通過減少動物疾病來提高其生產性能和飼料轉化率，但由于細菌抗藥性的發展和對人類健康的潛在威脅，抗生素的使用一直存在爭議[1]。因此，尋求有效的營養添加劑成為新時代養殖行業的重中之重。枸杞種植、加工和利用是寧夏的一項重點產業，枸杞副產物是指在枸杞種植和加工過程中，產生大量的枸杞枝、葉和殘渣。這些剩余物通常當作廢棄物處理，未得到科學有效利用，導致資源浪費和環境污染，同時增加生產成本。研究表明，枸杞副產物中富含粗脂肪(ether extract，EE)、粗蛋白質(crude protein，CP)、鈣和磷等營養物質，營養價值豐富且無耐藥性，是畜禽良好的飼料來源[2]，可代替抗生素增強動物機體的免疫力。多糖、黃酮、類胡蘿卜素、有機酸、氨基酸等是枸杞副產物中活性物質[3]，其中枸杞多糖是枸杞副產物中主要功能性成分，具有抗氧化、免疫刺激、抗應激、抗炎抑菌、增強血糖控制能力等生物活性[4]。枸杞多糖在飼喂動物方面的研究已有報道。Long等[5]研究發現，飼糧中添加枸杞多糖能提高肉仔雞生長性能、消化酶活性、抗氧化能力和免疫功能。佘祿明等[6]研究發現，飼糧中添加高劑量枸杞多糖顯著增加斷奶仔豬生長性能。Tan等[7]研究發現，飼料中添加枸杞提取物可以促進雜交石斑魚生長和蛋白質沉積。目前，國內外對枸杞產品在動物生產應用研究多集中在枸杞多糖的功效與作用，而有關枸杞副產物利用方面的報道較少。

我國檸條主要利用方式多集中在改善生態環境方面，檸條種植6～8年后出現生長衰退、生產力下降的現象，因此檸條的平茬復壯極為關鍵[8]。合理的平茬不僅能夠保護檸條正常生長，還能夠帶來豐富的飼草資源。與其他優質粗飼料相比，檸條木質化程度高，適口性和養分平衡性較差，因此檸條作為飼料開發利用的量較小，一般家畜食用的只是當年生幼嫩枝葉。近年來檸條飼料處理技術呈多樣化，突出表現在氨化、青貯和粉碎制粒等方面[9]，提高了檸條作為家畜飼料的利用率、適口性和營養價值。檸條的可溶性碳水化合物含量低，蛋白質含量和緩沖能高，單獨青貯不易成功。國內對檸條青貯調制及利用的研究已見報道，添加劑對檸條青貯飼料發酵品質影響的研究也有所開展[10-12]，但不同研究的檸條青貯飼料發酵品質差異較大。本研究以不同添加量的枸杞副產物與檸條錦雞兒混合青貯為材料，分析混合青貯發酵過程中營養成分、發酵品質、有氧穩定性及微生物多樣性的變化情況，旨在為提高檸條青貯品質和拓寬草食家畜優質飼草料來源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣地概況

試驗地為寧夏自治區吳忠市鹽池縣十六堡新村，位于寧夏東部，在我國北方農牧交錯帶北緣，東經107°41′，北緯37°37′。屬典型的大陸性季風氣候，氣候干燥，降水量少而集中。年平均溫度7.7 ℃，年平均日照2 867.9 h，平均無霜期128 d，年平均降水量270 mm，主要集中在7—9月。年平均蒸發量2 727.24 mm，大約是全年降水量的9.6倍。土壤類型主要為灰鈣土、風沙土[13]。

1.2 試驗材料

試驗于2019年6—9月在寧夏大學農學院草業科學實驗室進行，選用盛花期檸條錦雞兒品種，于2019年6月刈割，刈割后，由Aurora型手持式近紅外光譜儀確定水分含量，加入蒸餾水將含水量調制在60%左右進行青貯。試驗所用枸杞副產物由寧夏某生物科技有限公司饋贈，檸條錦雞兒和枸杞副產物營養成分如表1所示。

表1 檸條錦雞兒和枸杞副產物營養成分(干物質基礎)Table 1 Nutrient composition of Caragana korshinskii and Lycium barbarum by-product (DM basis) %

1.3 試驗設計

試驗采用單因素完全隨機設計，分為4個組，每組6個重復。各組檸條錦雞兒原料中枸杞副產物添加量分別為0(對照組)、3%(L3組)、6%(L6組)和9%(L9組)。將檸條錦雞兒原料用鍘刀鍘成2 cm的小段，將枸杞副產物均勻的拌于原料之中，裝于500 mL青貯罐中壓實，瓶口直徑92 mm，封蓋高97 mm，密度約為775 kg/m3，每罐350 g，青貯時間為60 d。

1.4 原料取樣與測定

1.4.1 營養成分

分別取檸條錦雞兒、枸杞副產物原料及青貯60 d后檸條錦雞兒500 g置凍干機中凍干，凍干后再次稱量，計算干物質(dry matter，DM)含量。經粉碎機粉碎，過40目篩，裝袋置干燥處保存。CP、EE、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)含量參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[14]進行。

相對飼喂價值(RFV)=[(88.9-0.779ADF)×
120/NDF]/1.29。

1.4.2 發酵品質

稱取5 g樣品于錐形瓶中，加入45 mL蒸餾水，振蕩30 min，并使樣品完全浸入水中，用封口膜封口，于4 ℃下保存24 h，用4層紗布過濾取上清液，使用雷磁PHS-3G精密pH計測定pH。氨態氮/總氮(AN/TN)的測定采用苯酚-次氯酸鈉比色法[15]。

1.4.3 有氧穩定性

有氧穩定性的測定，在發酵60 d后打開全部發酵袋青貯，將溫度記錄儀(HOBO Pendant Temperature/Light，美國)放入發酵袋幾何中心處，封口并在青貯袋上刺小孔，置于室溫下保存，使空氣可以自由進入袋中。同時在室內不同位置放置3個溫度記錄儀。若青貯袋中的溫度高于室溫2 ℃，則說明青貯開始腐敗變質，計算開袋至腐敗變質的時間，即為有氧穩定性。

1.4.4 微生物多樣性分析

1.5 數據處理

使用Excel 2010對測定指標數據預處理，再使用SPSS 23.0統計分析軟件中廣義線性模型(GLM)進行單因子方差分析和Duncan氏法多重比較，P<0.05為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 不同添加量枸杞副產物對檸條錦雞兒青貯營養成分的影響

由表2可見，各組之間DM含量無顯著差異(P>0.05)。L9組CP含量最高，為11.74%，顯著高于其他各組(P<0.05)。L9組EE含量最高，為7.13%，顯著高于其他各組(P<0.05)。各組之間WSC含量無顯著差異(P>0.05)，其中L9組最高，為0.33%；對照組最低，為0.29%。L6組和L9組多糖含量顯著高于對照組(P<0.05)，分別比對照組提高了1.52%和1.83%。NDF含量隨枸杞副產物添加量的增加而降低，L9組NDF含量最低，為62.27%，顯著低于其他各組(P<0.05)。L9組ADF含量最低，為53.14%，顯著低于其他各組(P<0.05)。L9組相對飼喂價值顯著高于其他各組(P<0.05)。

表2 不同添加量枸杞副產物對檸條錦雞兒青貯營養成分的影響(干物質基礎)Table 2 Effects of different supplemental levels of Lycium barbarum by-product on nutrient composition of Caragana korshinskii silage (DM basis) %

2.2 不同添加量枸杞副產物對檸條錦雞兒青貯發酵品質的影響

由表3可知，添加枸杞副產物可降低檸條錦雞兒青貯pH，其中對照組pH最高，為5.17；L9組pH最低，為4.13，顯著低于對照組(P<0.05)；L6組和L9組pH在4.8以下，達到良好青貯飼料水平。L6組和L9組NH3-N/TN顯著低于對照組(P<0.05)，其中L9組NH3-N/TN最低，為4.87%。L9組乳酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)，比對照組提高了1.2%。L6組和L9組乙酸和丙酸含量顯著低于對照組(P<0.05)，與L3組差異不顯著(P>0.05)。L6組和L9組乳酸/乙酸顯著高于對照組(P<0.05)。各組未檢測到丁酸含量。

表3 不同添加量枸杞副產物對檸條錦雞兒青貯發酵品質的影響(干物質基礎)Table 3 Effects of different supplemental levels of Lycium barbarum by-product on fermentation quality of Caragana korshinskii silage (DM basis) %

2.3 不同添加量枸杞副產物對檸條錦雞兒青貯有氧穩定性的影響

由圖1可知，在有氧暴露后，各組有氧穩定性分別為49.7、51.8、58.3、53.8 h，均超過49.0 h，即在有氧暴露49.0 h內均未發生有氧腐敗。L6組和L9組有氧穩定性顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4 不同添加量枸杞副產物對檸條錦雞兒青貯微生物多樣性的影響

2.4.1 Alpha多樣性指數

由表4可知，各組的覆蓋度均大于0.99，說明結果可以代表樣本微生物群落的真實情況。L3組、L6組和L9組Chao指數和ACE指數均顯著高于對照組(P<0.05)，說明枸杞副產物可以增加檸條錦雞兒青貯微生物豐度。L3組和L9組Shannon指數顯著高于對照組(P<0.05)，說明枸杞副產物能提高檸條錦雞兒青貯微生物多樣性。對照組Simpson指數最高，顯著高于L3組和L9組(P<0.05)，說明對照組的微生物群落組成的豐富度和均勻度更低。

表4 Alpha多樣性指數Table 4 Alpha diversity indexes

2.4.2 微生物群落組成

由圖2可知，根據高通量測序結果在屬水平上分析核心菌群，結果表明不同樣本在屬水平優勢菌群相似，但相對豐度不同。其中，青貯過程中乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度高于其他菌屬，也從微生物的角度說明枸杞副產物處理的檸條錦雞兒青貯中，乳桿菌屬為優勢菌屬，其隸屬于厚壁菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、乳桿菌科，是導致樣本中厚壁菌門微生物相對豐度高的直接原因。片球菌屬(Pediococcus)和腸球菌屬(Enterococcus)相對豐度次之。與對照組相比，L3組、L6組和L9組微生物群落中不僅發現了乳桿菌屬，還有一定數量的魏斯氏菌屬(Weissella)和腸桿菌屬(Enterobacter)等在發揮作用，對于降低發酵環境的pH和提高有機酸的含量有重要作用。

2.4.3 微生物群落Venn圖

由圖2可知，在OTU水平上分析了檸條錦雞兒青貯前后微生物群落組成情況，青貯前的檸條錦雞兒OTU數最多，達568個，特有的OTU數為378個。青貯后，L9組OTU數和特有OTU數最高，分別為218和45個；對照組特有OTU數最少，為3個；所有組共有的OTU數為30個。這說明與對照組相比，L3組、L6組和L9組的微生物多樣性均有所增加。

數據柱標注相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 枸杞副產物對檸條錦雞兒青貯營養成分的影響

枸杞副產物中含有較高的CP、EE和消化能，歸于能量飼料原料。檸條錦雞兒青貯中添加枸杞副產物，可以降低水分含量，有助于改善檸條錦雞兒營養成分。飼料中多糖是瘤胃微生物的重要能量和碳源[17]。本研究中，添加枸杞副產物組DM損失減少，青貯過程中發酵底物充足，枸杞副產物中的碳氮源轉換為有機酸，使pH下降，促進青貯時乳酸發酵，有效地抑制了酵母菌及霉菌等有害菌增殖，減緩DM與營養成分損失。由于檸條錦雞兒和枸杞副產物中CP含量較高，經過混合青貯后貯后各組的CP含量高于單一檸條錦雞兒青貯，且隨枸杞副產物添加量的增加，檸條錦雞兒青貯的CP含量增加，與成啟明等[10]試驗結果一致。L9組WSC含量增加，推測枸杞副產物抑制乳酸菌的生長，且木質纖維素降解過程中產生過量WSC未被微生物完全利用或無法被微生物利用[18]。枸杞中含有多種生物活性成分，如黃酮類化合物、枸杞多糖，枸杞多糖具有促進生長、調節免疫力、消炎抑菌等多種生物學功能。本研究中，添加9%枸杞副產物顯著提高了檸條錦雞兒青貯中多糖含量。研究表明，在雞、豬、兔及反芻動物飼糧中添加適量的枸杞多糖，可增強動物免疫力，提高生長性能及改善肉品質，一定程度上提高了畜禽養殖的經濟效益[19]。本試驗中，添加枸杞副產物有效降低了檸條錦雞兒青貯中NDF和ADF含量，推測枸杞副產物為乳酸菌和纖維素分解菌等飼用菌提供了充足的能源，促進了纖維素分解菌對青貯飼料細胞壁的破壞，降解纖維成分。NDF和ADF含量是反映纖維質量好壞的有效指標，ADF含量與動物消化率呈負相關，ADF含量越低，飼草的消化率越高，相對飼用價值越大[20]。這與本研究結果的變化趨勢基本一致，說明添加枸杞副產物對保存營養成分、提高相對飼喂價值有一定作用。

Lactobacillus：乳桿菌屬；Pediococcus：片球菌屬；Enterobacter：腸桿菌屬；Enterococcus：腸球菌屬；Weissella：魏斯氏菌屬；Vibrio：弧菌屬；Halomonas：鹽單胞菌屬；Kosakonia：小坂菌屬；Rhodococcus：紅球菌屬；Pantoea：泛菌屬；Sphingomonas：鞘氨醇單胞菌屬；Marinilactibacillus：海生乳桿菌屬；Staphylococcus：葡萄球菌屬；Hymenobacter：薄層菌屬；Others：其他。

圖3 微生物群落Venn圖Fig.3 Venn map of microbial community

3.2 枸杞副產物對檸條錦雞兒青貯發酵品質的影響

pH和氨態氮是評定青貯發酵品質的重要指標，反映了腐敗菌分解程度，較低的pH更有利于青貯飼料的長期穩定保存。本試驗中，在添加枸杞副產物的各組中，隨著枸杞副產物添加量逐漸提高，pH隨之下降。初期檸條錦雞兒青貯中大量碳水化合物轉化為乳酸，一定程度上抑制了檸條錦雞兒青貯中腐敗菌的生長，導致pH下降。NH3-N/TN反映青貯飼料中蛋白質和氨基酸分解程度，正常青貯飼料中蛋白質只分解至氨基酸，氨存在則表明有腐敗現象，NH3-N/TN越大，說明蛋白質和氨基酸分解得越多，意味著青貯飼料品質不佳。本研究中，L6組和L9組NH3-N/TN顯著低于對照，且均低于10%，這與Fang等[21]和于浩然等[22]的研究結果一致，說明添加枸杞副產物降低了蛋白質水解程度，青貯發酵品質較好[23]。本試驗中，添加枸杞副產物能降低檸條錦雞兒青貯pH、NH3-N/TN及乙酸和丙酸含量，提高乳酸含量。乳酸的生成是由于青貯中乳酸菌利用自身的酶類物質，通過糖酵解(EMP)途徑降解了枸杞副產物中的碳水化合物(如葡萄糖)，進而發酵產生了以乳酸、石酒酸和草酸為主的有機酸[24-25]，因此添加枸杞副產物可提高乳酸含量。這說明添加枸杞副產物可以促進檸條錦雞兒青貯中乳酸發酵，提高青貯飼料的發酵品質和營養價值，與王保平[26]研究結果相似。在青貯開袋后，由于表層壓實密度降低，青貯料與空氣接觸，導致青貯中的酵母菌、霉菌等好氧微生物開始活躍，使得青貯料變質進程開始，其中好氧微生物利用青貯中的營養物質進行大量繁殖。檸條錦雞兒青貯在開袋49.7～58.3 h后已經開始變質，說明好氧微生物的霉菌和酵母菌開始快速繁殖。較低的pH為青貯提供穩定的發酵環境，可以更好地抑制腐敗菌生長，使有氧穩定時間延長，而酵母菌可以利用乳酸產生酒精，并發生有氧變質[27]。添加枸杞副產物改善了檸條錦雞兒青貯有氧穩定性，推測枸杞副產物中的枸杞多糖等活性物質抑制了腐敗微生物，如酵母菌和霉菌的生長繁殖，從而降低了對青貯飼料營養物質的消耗利用。

3.3 枸杞副產物對檸條錦雞兒青貯微生物多樣性的影響

微生物多樣性指數Chao指數逐漸增加，樣品中OTU數也隨之增加。本試驗中，隨著枸杞副產物添加量的增加，檸條錦雞兒青貯中細菌的物種總數增加，整個發酵環境適合細菌的生長與繁殖。添加枸杞副產物組的Shannon指數升高，Simpon指數降低，說明添加枸杞副產物組的微生物多樣性處優勢地位，推測檸條錦雞兒發酵過程中微生物利用了氨基酸或水解了蛋白質，導致微生物多樣性增加。

不同處理的青貯飼料中微生物多樣性具有明顯差異。本試驗中，對照組微生物多樣性較低，乳桿菌屬相對豐度較高，可能是發酵底物較少，發酵過程中乳桿菌屬占優。有研究發現，乳桿菌屬是青貯發酵飼料菌群的關鍵菌屬[28]。李鳳姿[29]在酸菜發酵中添加乳酸桿菌后，總酸含量顯著提高，pH顯著降低。本試驗在添加枸杞副產物后，檸條錦雞兒青貯中發揮主要作用的乳酸菌為乳酸桿菌，此結果與Bai等[30]試驗結果一致。在青貯中常見的乳酸桿菌有布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、植物乳桿菌、戊糖乳桿菌及干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)等[31]。隨著青貯發酵時間的延長，pH不斷降低，較耐酸的乳桿菌屬微生物更具優勢，這可能是導致其相對豐度最高的主要原因。有研究證明，在青貯過程中參與乳酸發酵的細菌菌群主要有乳桿菌屬、片球菌屬、魏斯氏菌屬和腸球菌屬[32-33]。本試驗中，與對照組相比，L3組、L6組和L9組腸球菌屬和魏斯氏菌屬相對豐度增加，L6組和L9組片球菌屬相對豐度增加。片球菌是同型發酵乳酸菌，能產生更多乳酸。添加枸杞副產物后檸條錦雞兒青貯中不只1種乳酸菌在發揮作用，片球菌、腸球菌及魏斯氏菌在共同發揮作用，可能是枸杞副產物中的枸杞多糖作為益生元被乳桿菌吸收、利用，從而起到了增菌作用。這與Tohno等[33]報道的青貯過程中乳酸菌屬主要為乳桿菌、片球菌和腸球菌的結果相一致。枸杞副產物可改變檸條錦雞兒青貯的微生物群落組成，降低檸條錦雞兒青貯中乳桿菌屬的相對豐度，增加片球菌屬的相對豐度，產生更多乳酸[34]，進一步說明枸杞副產物可增加檸條錦雞兒青貯中乳酸含量，改善發酵品質。

4 結 論

① 添加枸杞副產物改善了檸條錦雞兒青貯的營養價值、發酵品質和有氧穩定性。

② 添加枸杞副產物改變了檸條錦雞兒青貯的微生物群落結構，增加了魏斯氏菌屬和腸球菌屬的相對豐度，降低了乳桿菌屬的相對豐度。

③ 綜合考慮，枸杞副產物添加量為9%時檸條錦雞兒的青貯效果最好。