飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃發酵及細菌菌群的影響

尹夢潔 汪水平 冉 濤 陳 凱 楊大盛 劉 勇 湯少勛* 黃 棋 張永康 譚支良

(1.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，動物營養生理與代謝過程湖南省重點實驗室，畜禽養殖污染控制與資源化技術國家工程實驗室，亞熱帶農業生態過程重點實驗室，長沙 410125；2.西南大學動物科學技術學院，重慶 402460)

非結構性碳水化合物(nonstructural carbohydrate，NSC)是反芻動物重要的能量來源之一。幼齡反芻動物的健康狀況與成年畜生產水平密切相關，由于其瘤胃發育尚不完善，對纖維物質的消化能力較弱，其主要依靠降解NSC獲取能量。NSC主要包括可溶性糖和淀粉。根據淀粉的分子結構，可將其分為直鏈淀粉和支鏈淀粉[1]。直鏈淀粉易老化形成抗性淀粉，阻止內源淀粉酶接近，難以被機體直接利用，但能被消化道微生物降解，從而有益于腸道健康[2]。支鏈淀粉在瘤胃內降解速率快，能迅速為機體提供能量，有效促進瘤胃上皮發育。但是，支鏈淀粉進食量過高，會使揮發性脂肪酸(VFA)快速累積，可能引起瘤胃pH下降，誘發亞急性或急性瘤胃酸中毒，進而危害瘤胃健康，反而不利于瘤胃上皮發育[3]。因此，通過調控飼糧中淀粉結構的組成比例，進而調節瘤胃發酵過程以促進羔羊瘤胃發育、維持和提升瘤胃功能的穩定是動物營養學家關注的焦點之一。研究表明，當飼糧直鏈/支鏈淀粉比例從0.12增加到0.48時并不影響羔羊瘤胃細菌多樣性、均勻度和豐度[4]。而給斷奶前羔羊補飼直鏈/支鏈淀粉比例為0.11～0.44的飼糧時，會顯著降低羔羊瘤胃上皮乳頭長度及上皮各層的厚度[5]。Wang等[2]發現，給山羊飼喂高直鏈淀粉飼糧，不僅會改善瘤胃pH及VFA濃度與組成，還可改善機體葡萄糖代謝、氮代謝及健康狀況。進一步提高飼糧直鏈淀粉比例是否會改善瘤胃功能及其上皮形態目前并不清楚。因此，本試驗以高直鏈玉米淀粉(簡稱高直玉米)替代正常玉米淀粉，配制3種不同直鏈/支鏈淀粉比例的飼糧，研究其對斷奶羔羊瘤胃液物理特征、瘤胃細菌組成、瘤胃發酵及其上皮乳頭形態特征等的影響，以明晰直鏈淀粉對斷奶羔羊的營養生理作用，并為飼糧配制提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用試驗羊及高直鏈淀粉分別由瀏陽某研發中心和海南某科技有限公司提供。

1.2 試驗動物及飼養管理

選取27頭體況良好、體重為(8.97±0.19) kg的3月齡湘東黑山羊斷奶羔羊，將其隨機分為3組，每組9頭，其中公羔4頭，母羔5頭。所有試驗羊統一驅蟲，單籠飼養，每日飼喂2次(09:00和17:00)，自由飲水。試驗期間密切觀察試驗羊采食規律、行為表現及健康狀況。

1.3 試驗飼糧

試驗飼糧配方與陳凱等[6]的研究相同，飼糧精粗比設為60∶40，直鏈/支鏈淀粉比例分別約為0.263、0.611和1.833，飼糧精料組成與營養水平見表1。粗料為苜蓿干草，鍘短，長度為1～2 cm；精料經2.5 mm篩粉碎。試驗羊自由采食，根據當日剩料量調整后1 d的投料量。

表1 精料組成與營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of concentrates (DM basis) %

1.4 試驗設計

采用單因子隨機區組試驗設計，將3種飼糧隨機分配給3組試驗羊。試驗期共35 d，其中1～7 d為預試期，8～35 d為正試期。預試期內，在同一飼養管理條件下，將飼糧逐步過渡到試驗羊各自的試驗飼糧。

1.5 樣品采集及預處理

在正式期結束的第2天晨飼前，對所有試驗羊處以安樂死，取出的瘤胃液經4層紗布過濾后立即測定瘤胃液Zeta電位、電泳速率及表面張力。同時，從瘤胃腹側、背側、前部、后部及中間5個位點共取內容物約100 g，立即用4層紗布過濾，濾液裝入1.5 mL無菌無酶管，濾渣裝入50 mL無菌無酶管，迅速放入液氮速凍后，-80 ℃保存待測。從瘤胃頂部、中部及底部分別剪取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小的組織塊放入事先準備好的固定液(賽維爾生物技術公司生產，主要成分為多聚甲醛和磷酸鹽緩沖液)中固定。

1.6 指標測定

1.6.1 瘤胃液表面張力與電化學指標

用JYW-200B全自動界面張力儀(承德市科承試驗機器有限公司)測定瘤胃液表面張力。用Zeta電位分析儀(Brookhaven Instruments company)測定瘤胃液Zeta電位與電泳速率等電化學指標。

1.6.2 瘤胃液微生物酶活性

參照試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提供的方法測定瘤胃液中性蛋白酶、α-淀粉酶、中性木聚糖酶及纖維素酶等微生物酶活性；參照試劑盒(南京建成生物工程研究所)提供的方法測定瘤胃液蛋白質含量。

中性蛋白酶活性單位(U)定義為30 ℃、堿性條件下每分鐘每毫克蛋白質水解產生1 μmol酪氨酸的量為1個酶活性單位。α-淀粉酶活性單位(U)定義為40 ℃、中性條件下每分鐘每毫克蛋白質催化產生1 mg還原糖的量為1個酶活性單位。中性木聚糖酶活性單位(U)定義為50 ℃、pH 6.0下每分鐘每毫克蛋白質水解木聚糖產生1 μmol還原糖的量為1個酶活性單位。纖維素酶活性單位(U)定義為40 ℃、中性條件下每分鐘每毫克蛋白質催化產生1 μg還原糖的量為1個酶活性單位。

1.6.3 瘤胃內容物微生物qPCR定量

采用Light Cycler 480 Ⅱ實時熒光定量PCR儀[羅氏診斷產品(上海)有限公司]測定瘤胃內容物濾液中總細菌、真菌、產甲烷菌、黃色瘤胃球菌、產琥珀酸絲狀桿菌、反芻獸新月形單胞菌、棲瘤胃普雷沃氏菌、普雷沃氏菌屬及嗜淀粉瘤胃桿菌等微生物的數量。參照Yu等[7]的方法提取細菌DNA。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，質粒DNA提取試劑盒購于艾科瑞生物工程有限公司，實時定量PCR試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。質粒構建和標準曲線的制作參照焦金真等[8]的方法進行。微生物qPCR引物序列見表2。

表2 微生物qPCR引物序列Table 2 Microbial qPCR primer sequences

稱取約3 g瘤胃內容物濾渣，用20 mL生理鹽水洗滌，振蕩30 s，350 r/min離心5 min，沉淀物用20 mL含15%吐溫80的生理鹽水在0 ℃環境下振蕩2.5 h，4 ℃、15 000 r/min離心15 min后棄去上清液，沉淀物用于測定上述微生物的數量，操作方法與步驟相同。

1.6.4 瘤胃液VFA的含量

參考Wang等[13]的方法測定VFA含量。發酵結束后，取2 mL發酵液，在15 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min后，取1 mL上清液于1.5 mL離心管，加入0.1 mL 25%偏磷酸固定，靜置15 min。使用1 mL注射器抽取0.8 mL液體過水系0.22 μm濾膜(天津市科億隆實驗設備有限公司)后裝入上機瓶中，利用液體進樣氣相色譜儀(安捷倫7890A，美國)測定發酵液中各VFA含量。

1.6.5 瘤胃乳頭形態特征

委托武漢塞維爾生物科技有限公司對瘤胃組織樣品進行包埋和切片。使用BX51正置熒光顯微鏡(Olympus Corporation)觀察瘤胃乳頭高度、寬度及絨毛面積。每張切片選取4個形態較好的瘤胃乳頭進行觀測，將瘤胃3個部位的所有數據歸類取平均值進行統計。

1.7 統計分析

用Excel 2010軟件對數據進行基本處理，結果采用SPSS 19.0軟件中的GLM模塊進行方差分析和顯著性檢驗，采用Duncan氏法進行多重比較，P≤0.05表示差異顯著，0.05

2 結果與分析

2.1 瘤胃液表面張力與電化學指標

由表3可知，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃液表面張力及瘤胃液Zeta電位與電泳速率等電化學指標均無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃液表面張力與電化學指標的影響Table 3 Effects of dietary amylase/amylopectin ratio on surface tension and electrochemistry parameters of rumen fluid in weaned lambs

2.2 瘤胃液微生物酶活性

由表4可知，改變飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對瘤胃液中性蛋白酶、α-淀粉酶及纖維素酶活性無顯著影響(P>0.05)。提高飼糧直鏈/支鏈淀粉比例顯著提高中性木聚糖酶活性(P<0.05)，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為1.833時，其瘤胃液中性木聚糖酶活性分別比飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為0.611和0.263的組高341%和518%。

表4 飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃液微生物酶活性的影響Table 4 Effects of dietary amylase/amylopectin ratio on microbial enzyme activities of rumen fluid in weaned lambs U/mg prot

2.3 瘤胃內容物細菌數量

由表5可知，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃內容物液相總細菌、真菌、產甲烷菌、黃色瘤胃球菌、產琥珀酸絲狀桿菌、反芻獸新月形單胞菌、普氏菌屬及嗜淀粉瘤胃桿菌等微生物數量均沒有顯著影響(P>0.05)。飼糧直鏈/支鏈比例對斷奶羔羊瘤胃內容物固相細菌菌群的影響與液相相似，但提高飼糧直鏈/支鏈比例時，固相內容物中棲瘤胃普雷沃氏菌數量會顯著下降(P<0.05)。

表5 飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃內容物微生物數量的影響Table 5 Effects of dietary amylase/amylopectin ratio on microbial population of rumen digesta in weaned lambs lg(copy/g)

2.4 瘤胃液VFA組成

由表6可知，提高飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃液總VFA的濃度以及乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸濃度和乙酸/丙酸均無顯著影響(P>0.05)。

表6 飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃液VFA組成的影響Table 6 Effects of dietary amylose/amylopectin ratio on VFA composition of rumen fluid in weaned lambs

2.5 瘤胃上皮乳頭形態特征

由圖1和表7可知，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃乳頭高度、寬度與表面積均無顯著影響(P>0.05)，但飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為1.833時，瘤胃上皮乳頭寬度相對飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為0.611組提高17.0%(P=0.010)。

表7 飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對斷奶羔羊瘤胃乳頭形態特征的影響Table 7 Effects of dietary amylase/amylopectin ratio on morphological characteristics of rumen papilla in weaned lambs

圖1 斷奶羔羊瘤胃上皮乳頭形態特征Fig.1 Morphological characteristics of rumen epithelial in weaned lambs (200×)

3 討 論

3.1 瘤胃液表面張力與電化學指標

表面張力是液體物質的特性，其大小對瘤胃發酵、微生物活性及酶活性及微生物的黏附能力都有影響[14-15]，并受兩相界面中離子濃度的影響，一般隨溶質濃度的增加而降低，而且乙酸、丙酸、丁酸等有機酸都有降低溶液表面張力的作用[16]。本試驗發現，3組試驗羊的瘤胃液表面張力在48.8～51.1 mN/m，略低于瘤胃液正常表面張力范圍(50～69 mN/m)[17]，這可能與本研究飼糧中淀粉含量較高、生成較多的有機酸(如乙酸、丙酸、丁酸等)有關，進而降低了瘤胃液的表面張力。張芳芳[4]采用精料淀粉含量為44%左右的飼糧飼喂斷奶羔羊35 d時，瘤胃液總VFA濃度(44～47 mmol/L)低于本研究采用精料淀粉含量為50%～55%的飼糧飼喂斷奶羔羊35 d的結果(53～57 mmol/L)。由于可供參考的文獻相當少，引起瘤胃液表面張力降低的具體原因還需更多研究加以證實。本研究中改變飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對瘤胃液表面張力無顯著影響，產生這種結果可能與本試驗各組均采用相同的粗飼料，而精飼料中的淀粉含量相同，進而3組試驗羊瘤胃液總VFA濃度相近有關。微生物表面界面電動勢，即Zeta和電泳速率，表示微生物表面固液界面上電勢差，是反映微生物表面物理化學特性的因素之一，它與微生物的黏附過程及生物膜的形成有關[18]。Zeta電位絕對值越高，則微生物聚集程度越低，體系越穩定，并且死亡細菌的Zeta電位絕對值更低[19]。本試驗結果表明，改變飼糧直鏈/支鏈淀粉比例不會影響瘤胃微生物體系的穩定性，同時也說明3組的微生物體系的穩定性相近。

3.2 瘤胃內容物微生物數量及酶活性

飼糧化學成分及其攝入量是影響瘤胃微生物區系的關鍵因素。嗜淀粉瘤胃桿菌、棲瘤胃普雷沃氏菌及反芻獸新月形單胞菌是主要的淀粉降解菌，瘤胃球菌與產琥珀酸絲狀桿菌是主要的纖維降解菌。棲瘤胃普雷沃氏菌是瘤胃數量較多的一類細菌，具有降解淀粉、植物細胞壁多糖及蛋白質的能力[15]。本試驗中，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對瘤胃液相內容物優勢菌種數量無顯著影響，這可能與本試驗中3組飼糧的蛋白質與纖維等的含量與來源都比較一致有關。但當飼糧直鏈/支鏈淀粉比例提高到0.611以上時顯著降低瘤胃固相內容物中棲瘤胃普雷沃氏菌的數量，棲瘤胃普雷沃氏菌的數量主要與底物蛋白質含量和能量水平有關[20]。本試驗中發酵底物蛋白質含量差異較小，故引起棲瘤胃普雷沃氏菌數量差異的主要原因可能是飼糧直鏈/支鏈淀粉比例超過0.611的組別其總淀粉含量比0.263組低(表1)。由于試驗中酶活性的測定條件與瘤胃環境條件不一致，其降解飼糧養分的酶活性可能不完全能反映其真實的活性，但由于3組瘤胃液酶活性是在相同條件下進行測定的，因此研究結果在一定程度上可以反映飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對瘤胃液酶活性的影響。

飼糧中營養物質的降解效率的高低很大程度上受瘤胃內酶活性的影響，本試驗中提高飼糧直鏈/支鏈淀粉比例對瘤胃液中性蛋白酶、α-淀粉酶及纖維素酶活性無顯著影響，可能與3組間瘤胃內容物中合成上述酶相關微生物，如嗜淀粉瘤胃桿菌、瘤胃球菌、產琥珀酸絲狀桿菌和普氏菌屬等的數量變化較小有關；另外，1.833組的試驗羊瘤胃液中性木聚糖酶活性較其余2組要高。這可能與該組瘤胃固相內容物中含有產琥珀酸絲狀桿菌數量較多有關，其產琥珀酸絲狀桿菌數量相對其他2組高4.67%。此外，淀粉的降解程度以及酶的可及性與其結晶度呈負相關關系，結晶度越高淀粉的抗性越強[2]。直鏈淀粉含有大量氫鍵，可在淀粉分子表面形成致密的網狀結構，增加表面疏水性，降低淀粉溶解性，阻礙底物與酶的結合。Stevneb?等[21]對不同直鏈淀粉含量的大麥淀粉水解特性的研究表明，含高直鏈(36.0%～49.0%)或中等直鏈淀粉(23.1%～29.4%)的大麥淀粉的水解率比低直鏈淀粉(0～3.3%)的低34%～54%。本研究中，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為1.833組的直鏈淀粉含量較其余2組高(1.833組相對0.263組和0.611組直鏈淀粉含量分別高22.1%和13.4%)，進而淀粉的水解也低于其他2組。Huang等[22]發現，底物快速降解組分的終產物濃度與微生物纖維降解酶活性間呈負相關關系，增加可溶性碳水化合物組分，會使纖維降解酶活性降低，這可能也是直鏈/支鏈淀粉比例為1.833組的瘤胃液木聚糖酶活性高于其他2組的原因之一。飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為1.833組的中性洗滌纖維及酸性洗滌纖維消化率最高(分別為80.45%、72.90%)也可能與該組瘤胃液中性木聚糖酶活性較高有關[6]。本試驗中，雖然3組間瘤胃液α-淀粉酶活性差異不顯著，但其活性隨飼糧直鏈/支鏈淀粉比例的提高而降低，與前人的研究結果相同，說明直鏈淀粉對淀粉酶的降解有抗性作用，不易被瘤胃微生物降解。

3.3 瘤胃上皮乳頭形態特征

瘤胃壁凸起的乳頭可增大上皮與內容物的接觸面積，提高育肥羊瘤胃乳頭長度、寬度和密度等組織形態結構可提高育肥性能、屠宰性能和營養物質消化率[23]。在本試驗中，雖然3組間瘤胃乳頭高度無顯著差異，但提高飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為0.611時瘤胃乳頭高度相對0.263組和1.833組，分別提高了18.6%和10.2%，可能與該組瘤胃液中啟動瘤胃上皮發育的關鍵性短鏈脂肪酸-丁酸的濃度較高有關[24]，相對0.263組和1.833組，0.611組瘤胃液丁酸濃度分別提高了32.2%和41.5%。另外，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例提高到1.833時斷奶羔羊瘤胃上皮乳頭寬度相對0.263組和0.611組分別提高了8.12%和17.00%，同時，飼糧直鏈/支鏈淀粉比例提高到0.611或1.833時斷奶羔羊瘤胃乳頭表面積相對0.263組分別提高13.7%和20.3%，更有利于斷奶羔羊瘤胃對營養的吸收，這也可能是我們前期研究中發現飼糧直鏈/支鏈淀粉比例為0.611和1.833時羔羊平均日增重顯著高于0.263組的原因之一[6]，同時，結果說明適當提高飼糧直鏈淀粉比例可促進斷奶羔羊瘤胃乳頭發育。Zhao等[25]通過飼喂4種含不同淀粉來源的飼糧后發現，提高飼糧直鏈/支鏈淀粉比例可增大哺乳羔羊瘤胃乳頭面積，與本試驗結果相近。孫大明等[5]提高開食料直鏈/支鏈淀粉比例減少了哺乳羔羊瘤胃乳頭高度與面積，與本試驗結果不一致。上述試驗結果不同，可能與羊只生長階段、飼糧結構、營養組成及直鏈/支鏈淀粉設置比例等因素有關。

4 結 論

改變飼糧中直鏈/支鏈淀粉比例不會影響斷奶羔羊瘤胃微生物體系穩定性和瘤胃液表面張力；適當提高飼糧直鏈/支鏈淀粉比例可促進斷奶羔羊瘤胃上皮發育；提高瘤胃直鏈/支鏈淀粉比例會提高瘤胃液木聚糖酶活性；在湘東黑山羊斷奶羔羊飼糧中直鏈/支鏈淀粉比例不超過0.611較為適宜。