酵母硒對灘羊的生物安全性評價：生長性能、血液常規(guī)參數、硒蛋白基因表達以及富集規(guī)律

賈雪婷 郭曉青 韓云勝 李 敬 趙青余 張 凱 湯超華 馬 青 王 錦 趙正偉 張軍民 秦玉昌

(1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農業(yè)農村部華北動物遺傳資源與營養(yǎng)科學觀測實驗站，北京 100193；3.青島農業(yè)大學動物科技學院，青島 266109；4.寧夏農林科學院動物科學研究所，銀川 750002)

1973年，世界衛(wèi)生組織(WHO)正式確認硒是人和動物必需的微量營養(yǎng)元素[1]。硒主要以硒代半胱氨酸的形式通過UGA密碼子編碼參與合成硒蛋白，并以硒蛋白的形式發(fā)揮生物學功能[2]，參與機體氧化還原穩(wěn)態(tài)調控、甲狀腺激素代謝、免疫防御等多種生物進程[3-5]。目前，已在哺乳動物體內鑒定到的硒蛋白包括谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)家族、硫氧還原白還原酶(thioredoxin reductase，TXNRD)家族、甲狀腺素脫碘酶(iodothyronine deiodinase，DIO)家族、硒蛋白(selenoprotein，SELENO)P等。動物體長期硒攝入不足易導致氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡[6]，表現為生長緩慢、免疫力低下，并增加羊白肌病[7]、豬桑葚心、雞滲出性素質等多種營養(yǎng)代謝疾病的患病風險[8-9]，但長期過量的硒攝入同樣會增加Ⅱ型糖尿病、心血管疾病等多種疾病的易感性[10-11]。因此，在家畜飼養(yǎng)管理中，要嚴格控制飼糧中硒的添加量。常見的飼糧補充硒源包括無機硒(硒酸鹽、亞硒酸鹽)和有機硒(酵母硒、蛋氨酸硒)。與無機硒相比，有機硒因生物利用率較高、毒性較低、污染性較小，在生產實踐中應用更為廣泛[12-14]。郭軍蕊[15]研究了基礎飼糧中添加0.5、5.0 mg/kg蛋氨酸硒對肉雛雞飼用安全性的影響，結果表明，飼糧中添加5.0 mg/kg蛋氨酸硒可顯著提高肉雛雞血漿GPX活性和硒含量，但不會對肉雛雞正常生長發(fā)育造成明顯的不良影響。Tiwary等[16]發(fā)現羔羊口服2、3、4 mg/kg BW的亞硒酸鈉和4、6、8 mg/kg DM的蛋氨酸硒12～14 h后，羔羊出現明顯的采食量減少、呼吸急促等中毒現象。然而，關于酵母硒影響綿羊健康的安全性研究卻鮮有報道。本試驗以灘羊為研究對象，研究飼糧添加不同水平酵母硒對灘羊生長性能、血液常規(guī)參數、組織硒蛋白基因表達及組織器官硒含量的影響，評價酵母硒對灘羊的生物安全性，揭示硒在灘羊體內的生物富集規(guī)律，為酵母硒在綿羊養(yǎng)殖過程中的安全應用提供數據支撐，并提供酵母硒在綿羊飼糧中最高添加水平的安全參考系數。

1 材料與方法

1.1 試驗飼糧

基礎飼糧參照中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T 816—2004)[17]中肉用綿羊體重30 kg、日增重200 g時的營養(yǎng)需要配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1，基礎飼糧中硒含量為0.16 mg/kg。分別在基礎飼糧中添加28.94、105.46、258.51、564.60 mg/kg酵母硒(北京英聯馬利食品有限公司，硒含量為3 300 mg/kg)，使試驗飼糧硒含量分別為0.25(Ⅰ組)、0.50(Ⅱ組)、1.00(Ⅲ組)、2.00 mg/kg(Ⅳ組)。《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T 816—2004)[17]中推薦20～50 kg體重階段育肥羊對飼糧硒的需要量為0.18～0.31 mg/kg，因此本試驗Ⅰ組飼糧硒含量能滿足灘羊的硒營養(yǎng)需要；Ⅳ組飼糧硒含量為育肥羊對飼糧硒的最大耐受含量。酵母硒和飼糧硒含量均采用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)法進行測定[18]。飼糧添加酵母硒時需利用粉碎后的玉米粉作為載體，逐級稀釋，稀釋到一定量后，再與其余除玉米秸稈外經粉碎的飼料原料按照配方添加混勻，以保證酵母硒充分均勻的混合。用制粒機將混勻后的飼料原料壓制成直徑6 mm左右的顆粒料，于通風避光處保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.2 試驗動物、設計及飼養(yǎng)管理

試驗選用64只體重[(32±2) kg]相近、健康的鹽池灘羊公羔，隨機分為4組，每組16個重復，每個重復1只羊。試驗羊分欄飼養(yǎng)，每組隨機飼喂1種試驗飼糧，玉米秸稈和顆粒料混合飼喂，欄內單設飼槽和水槽，于每日07：00、17：00各飼喂1次，自由采食及飲水。按養(yǎng)殖場的常規(guī)程序進行免疫和消毒，保持圈舍自然通風。預試期10 d，正試期60 d。

1.3 樣品的采集與制備

分別于試驗第1天和第60天，空腹逐只稱量試驗羊體重。試驗期間，每天準確稱取羊只給料量，并回收記錄剩余料量。試驗結束后，每組選擇8只體重相近的灘羊，頸靜脈采集2份5 mL血液樣本。其中一份用肝素鈉抗凝管采集，在采血后2 h內使用全自動血液細胞分析儀(BC-5000 VET，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測定灘羊血液常規(guī)參數，包括紅細胞參數、白細胞參數、血小板參數等。另一份靜置1 h后，3 000 r/min、4 ℃離心10 min制備血清，分裝于1.5 mL凍存管，用于后續(xù)血清硒含量測定。血液樣品采集完成后，屠宰采血羊只，宰前禁食12 h、禁水2 h，宰后采集同一部位的背肌、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、心臟等組織器官樣品，液氮速凍，-80 ℃保存待測。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生長性能

記錄灘羊的初始體重(IBW)和終末體重(FBW)，計算各組的平均日增重(ADG)；統計正試期的耗料量，計算平均日采食量(ADFI)。

1.4.2 組織中硒蛋白mRNA相對表達量測定

1.4.2.1 引物設計與合成

依據NCBI數據庫公布的羊基因序列設計引物，并由北京三博遠志生物技術有限責任公司進行合成，引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.4.2.2 硒蛋白mRNA相對表達量測定

1.4.3 硒含量測定

血清及組織器官中硒含量采用ICP-MS法進行測定，其中樣品前處理方法參照中華人民共和國國家標準《食品安全國家標準食品中多元素的測定》(GB 5009.268—2016)進行[18]。準確稱取0.5 g固(液)態(tài)樣品(精確至0.001 g)于微波消解內罐中，加入8 mL硝酸，放置過夜，進行微波消解。微波消解儀消解程序為120 ℃保持5 min，150 ℃保持10 min，190 ℃保持20 min，升溫時間5 min。冷卻后取出，于167 ℃電熱板加熱1～2 h，溶液趕酸至黃豆粒大小，超純水稀釋定容至20 g，過0.45 μm水系濾膜，4 ℃保存待測硒含量，同時做空白及質控試驗。

儀器參數：安捷倫-電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS 7900，安捷倫科技有限公司)。射頻功率為1 550 W，等離子氣體流速為15 mL/min，載氣流速為1 L/min，氦氣流速為4.5 mL/min，蠕動泵轉數為0.1 r/s，霧化室溫度為2 ℃，提取透鏡2電壓為-200 V，Omega偏轉電壓為-85 V，Omega透鏡電壓為-7.9 V，采樣深度為10 mm，能量歧視電壓為5 V，積分時間為1 s，監(jiān)測同位素硒78、硒80、硒82，硒78用于定量計算。

1.5 數據統計與分析

應用SPSS 20.0軟件對所得數據進行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布后進行單因素方差分析(one-way ANOVA)。若有顯著差異則采用Duncan氏法對組間差異進行多重比較，采用正交多項式對比法確定飼糧酵母硒添加水平的線性和二次效應。P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著，P>0.10為差異不顯著，0.05≤P≤0.10為有顯著趨勢。

2 結 果

2.1 飼糧酵母硒添加水平對灘羊生長性能的影響

由表3可知，各組之間灘羊初始體重無顯著差異(P>0.05)。灘羊終末體重隨飼糧酵母硒添加水平增長先降低后升高，為41.09～44.24 kg。各組之間灘羊終末體重、ADG均無顯著差異(P>0.05)。方差分析表明，飼糧酵母硒添加水平有影響灘羊ADFI的趨勢(P=0.069)，但線性和二次分析未發(fā)現規(guī)律性變化(P>0.10)。

表3 飼糧酵母硒添加水平對灘羊生長性能的影響Table 3 Effects of dietary selenium yeast supplemental level on growth performance of Tan sheep

2.2 飼糧酵母硒添加水平對灘羊血液常規(guī)參數的影響

由表4可知，飼糧酵母硒添加水平對灘羊血液平均紅細胞體積、嗜酸性粒細胞計數以及紅細胞分布寬度標準差有顯著影響(P<0.05)。與Ⅰ組相比，Ⅲ組灘羊血液平均紅細胞體積、嗜酸性粒細胞計數顯著升高(P<0.05)。與Ⅱ組相比，Ⅳ組灘羊血液紅細胞分布寬度標準差顯著降低(P<0.05)。與Ⅲ組相比，Ⅳ組灘羊血液嗜酸性粒細胞百分數(P=0.098)、血小板分布寬度變異系數(P=0.079)均呈下降趨勢。灘羊血液平均紅細胞血紅蛋白量呈現出先升高后降低的二次變化(P<0.05)。飼糧酵母硒添加水平對其余血液常規(guī)參數均無顯著影響(P>0.05)。

表4 飼糧酵母硒添加水平對灘羊血液常規(guī)參數的影響Table 4 Effects of dietary selenium yeast supplemental level on blood routine parameters of Tan sheep

續(xù)表4項目Items組別 GroupsⅠⅡⅢⅣSEMP值 P-value方差分析ANOVA線性Liner二次Quadratic嗜酸性粒細胞百分數 Eos percentage/%1.601.351.691.190.0800.0980.2090.410嗜堿性粒細胞百分數 Bas percentage/%0.810.930.720.670.0420.1400.0940.335血小板類指標 Platelet indexes血小板計數 PLT count/(×109個/L)260.21316.44252.50244.9320.6910.6000.5670.449血小板分布寬度變異系數 PDW-CV/%15.2015.3915.4615.110.0540.0790.6810.073血小板壓積 PCT/%0.120.150.120.120.0090.6040.8060.387

2.3 飼糧酵母硒添加水平對灘羊肝臟和肌肉硒蛋白mRNA相對表達量的影響

由表5可知，在肝臟組織中，飼糧酵母硒添加水平對灘羊肝臟GPX1、GPX3、TXNRD1、DIO1的mRNA相對表達量有顯著或極顯著影響(P<0.05或P<0.01)。與Ⅰ組相比，Ⅲ組灘羊肝臟GPX1、GPX3的mRNA相對表達量呈二次極顯著升高(P<0.01)。與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組灘羊肝臟TXNRD1的mRNA相對表達量呈二次極顯著下降(P<0.01)，DIO1的mRNA相對表達量呈線性顯著下降(P<0.05)；Ⅲ組灘羊肝臟SELENOM的mRNA相對表達量呈下降趨勢(P=0.071)。在肌肉組織中，與Ⅲ組相比，Ⅳ組灘羊肌肉SELENOH的mRNA相對表達量呈下降趨勢(P=0.075)，GPX3的mRNA相對表達量呈先降低后升高的二次型變化(P<0.05)。各組之間灘羊肌肉硒蛋白mRNA相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。

表5 飼糧酵母硒添加水平對灘羊肝臟和肌肉硒蛋白mRNA相對表達量的影響Table 5 Effects of dietary selenium yeast supplemental level on mRNA relative expression levels of selenoprotein in liver and muscle of Tan sheep

續(xù)表5項目Items組別 GroupsⅠⅡⅢⅣSEMP值 P-value方差分析ANOVA線性Liner二次Quadratic谷胱甘肽過氧化物酶4 GPX41.041.200.920.740.0780.3010.1260.293硫氧還蛋白還原酶1 TXNRD11.011.160.760.730.0900.3590.1720.639硒蛋白H SELENOH0.850.680.980.450.0800.0750.1260.169硒蛋白P SELENOP0.800.971.250.940.1090.6050.5330.356硒蛋白W SELENOW2.703.484.311.740.4430.1930.5410.071硒蛋白M SELENOM0.891.010.930.720.0790.7670.5000.394硒蛋白N SELENON1.001.150.721.600.1200.1350.1730.119碘甲腺原氨酸脫碘酶2 DIO21.010.780.901.410.1460.6340.3940.276

2.4 飼糧酵母硒添加水平對灘羊血清及組織器官硒含量的影響

由表6可知，飼糧酵母硒添加水平對灘羊血清及組織器官硒含量有極顯著影響(P<0.01)，灘羊血清及組織器官硒含量隨飼糧酵母硒添加水平升高呈線性或二次極顯著增加(P<0.01或P<0.01)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組灘羊血清硒含量無顯著差異(P>0.01)，Ⅳ組灘羊血清硒含量極顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組(P<0.01)。隨著飼糧酵母硒添加水平的升高，灘羊背肌、肝臟、腎臟、肺臟、心臟、胰腺、十二指腸硒含量呈二次極顯著增加(P<0.01)，脾臟、睪丸硒含呈線性極顯著增加(P<0.01)。不同組織器官中硒含量由高到低排序均為Ⅳ組>Ⅲ組>Ⅱ組>Ⅰ組，與飼糧酵母硒添加水平趨勢相一致，且以肝臟、腎臟硒含量最高。

表6 飼糧酵母硒添加水平對灘羊血清及組織器官硒含量的影響Table 6 Effects of dietary selenium yeast supplemental level on content of selenium in serum and tissue and organ of Tan sheep mg/kg

3 討 論

3.1 飼糧酵母硒添加水平對灘羊生長性能的影響

盡管已有文獻廣泛報道了硒對不同動物生長性能的影響，但可能由于不同國家、不同地域土壤和農作物中硒的含量、存在形式以及生物有效性的差異，尚未獲得一致結論。鄒曉庭等[19]研究證實，增加育肥豬飼糧有機硒水平對提高其ADG具有促進作用。但據Mahan等[20]報道，飼糧不同有機硒水平不會對育肥豬ADG和ADFI造成顯著影響。張永翠等[21]研究發(fā)現，以酵母硒形式在杜寒雜交羊飼糧中添加0、0.2、0.4、0.8 mg/kg硒，羊的ADG、ADFI均無顯著變化。本試驗結果表明，飼糧酵母硒添加水平對灘羊終末體重、ADG、ADFI均無顯著影響，與上述研究結果基本一致。

3.2 飼糧酵母硒添加水平對灘羊血液常規(guī)參數的影響

血常規(guī)檢測即觀察體內血細胞組分變化及形態(tài)分布，主要包括白細胞參數、紅細胞參數、血小板參數三大組分[22]。粒細胞是構成機體免疫防御系統的重要成分之一[23]。本試驗中，中性粒細胞計數隨飼糧酵母硒添加水平升高呈升高趨勢，且在正常范圍內(1.8×109～6.3×109個/L)，灘羊體內中性粒細胞對細菌的吞噬能力有所增強[24]，提高了機體抵御病原入侵的防御力。嗜酸性粒細胞可以調節(jié)機體的局部免疫[25]，一般在0.05×109～0.30×109個/L變化。本試驗結果顯示，添加酵母硒至飼糧硒水平為1.00 mg/kg時可以在一定范圍內增強灘羊的機體免疫功能。灘羊血液平均紅細胞體積隨飼糧酵母硒添加水平升高呈先升高后下降趨勢，與張永翠等[21]的研究結果相近。血小板對機體的止血功能極為重要，一般來說血小板計數大于400×109個/L則表示血小板計數增多，易導致血栓發(fā)生率升高[21]。本試驗中，各組之間血小板計數無顯著差異，說明飼糧添加酵母硒不會對灘羊機體造成不利影響。

3.3 飼糧酵母硒添加水平對灘羊肝臟及肌肉硒蛋白mRNA相對表達量的影響

提高動物飼糧硒水平可優(yōu)化組織內多種硒蛋白基因表達，保障其生物學功能的正常發(fā)揮。GPX可將體內由不飽和脂肪酸過氧化生成的脂質過氧化物還原成無害的羥基化合物，使細胞免受氧化損傷[26]。本試驗結果顯示，灘羊肝臟GPX1、GPX3的mRNA相對表達量隨飼糧酵母硒添加水平升高二次極顯著上調，說明機體清除組織內有害過氧化物的能力有所增強，與Ibrahim等[27]的試驗結果相符。與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組灘羊肝臟TXNRD1的mRNA相對表達量有所下降，這與黃曉鳳[28]在肉雞上的研究結果相反，可能是由于物種差異的原因所導致。與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組灘羊肌肉中GPX1、SELENOP的mRNA相對表達量均有所升高，GPX4、TXNRD1、SELENOW、SELENOM的mRNA相對表達量在一定范圍有所升高。與肌肉組織相比，肝臟硒蛋白基因mRNA表達更易受飼糧酵母硒添加水平的調節(jié)作用，這與Zhang等[29]的試驗結論相似，可能原因為肝臟是硒經腸道吸收后經歷的第一個器官[30]，同時也是硒蛋白合成和硒代謝的主要器官，生物半衰期接近4 d，而肌肉是硒的主要貯存器官，生物半衰期接近12 d[31]，半衰期越長，說明蛋白質的合成降解代謝速率越慢，代謝活動不旺盛，可能導致肝臟組織中的硒蛋白基因mRNA表達比肌肉組織更易受飼糧酵母硒添加水平調控。綜上所述，隨著飼糧酵母硒添加水平的提高，灘羊肝臟及肌肉組織中多種硒蛋白基因mRNA相對表達量有所增長，這些硒蛋白所發(fā)揮的抗氧化等生物學功能得到增強。

3.4 飼糧酵母硒添加水平對灘羊血清及組織器官硒含量的影響

缺硒易導致機體多種病理過程的發(fā)生[32-33]。飼糧補硒不僅可以預防羊群缺硒疾病，同時也能增加羊血清及組織中的硒沉積。目前已有許多文獻證實了飼糧補充有機硒對動物體組織硒富集的促進作用。Falk等[34]研究表明，在生長豬基礎飼糧中補充酵母硒可顯著提高豬心肌和骨骼肌中硒含量。張永翠等[35]通過以酵母硒形式給杜寒雜交羊補充0、0.2、0.4、0.8 mg/kg硒發(fā)現，羊血清、肝臟、肌肉中硒含量均隨飼糧酵母硒補充水平增加呈上升趨勢。本試驗結果顯示，灘羊血清及組織器官中的硒含量隨著飼糧酵母硒添加水平的增長線性或二次升高，與上述研究結果基本一致。硒的沉積效率以肝臟和腎臟最高，與高建忠等[36]在仔豬上的研究結果相似，這可能是由肝臟和腎臟在硒的吸收與代謝過程中發(fā)揮的特殊功能決定的。肝臟是硒經吸收后到達的第一個器官[31]，也是硒蛋白合成與硒代謝的主要器官。硒被攝入體內后主要以硒代蛋氨酸的形式在體內轉化為硒代半胱氨酸，在β-裂解酶的作用下催化生成HSe-，參與硒蛋白合成[37]。在高硒攝入下，甲基轉移酶可使HSe-甲基化形成二甲基衍生物[38-39]，一小部分參與硒蛋白合成，其余主要經腎臟通過尿液排出體外，可能導致肝臟和腎臟中硒富集量明顯高于其余組織器官。Lu等[40]在30周齡蛋雞飼糧中添加0、0.3、1.5、3.0 mg/kg酵母硒(以硒計)，飼喂12周后發(fā)現，與0 mg/kg硒組相比，3.0 mg/kg硒組雞蛋及胸肉硒含量極顯著提高1 036.73%、2 127.93%，但補充高劑量酵母硒并未對蛋雞健康造成不良影響。結合上述結果，飼糧中補充酵母硒至飼糧硒水平達0.25～2.00 mg/kg時不會對灘羊生長性能、血液常規(guī)參數、組織硒蛋白基因表達以及組織器官硒含量造成不良影響。當補充酵母硒至飼糧硒水平達到0.25 mg/kg時，具有8倍的安全系數，即以2.00 mg/kg的硒水平飼糧飼喂灘羊是安全的。在不影響動物健康的前提下，飼糧補充高劑量酵母硒可極顯著提高灘羊血清及組織器官中硒的富集量。

4 結 論

① 以酵母硒為補充硒源，飼糧硒含量在0.25～2.00 mg/kg時不會對灘羊生長性能、血液常規(guī)參數以及組織硒蛋白基因表達產生負面影響。

② 以酵母硒為補充硒源，飼糧硒含量達0.25 mg/kg時，具有8倍的安全系數，對飼喂灘羊是安全的。

③ 隨著飼糧酵母硒添加水平的提高，灘羊血清及組織器官硒含量呈線性或二次極顯著增加。