妊娠-哺乳期飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽對母豬糞便菌群組成及代謝產物含量的影響

馬 翠 高乾坤 祝 倩 宋明彤 耿梅梅 韓 強 孔祥峰*

(1.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，亞熱帶農業生態過程重點實驗室，動物營養生理與代謝過程湖南省重點實驗室，長沙 410125；2.中國科學院大學，北京 100049；3.山東祥維斯生物科技股份有限公司，濰坊 261000)

甜菜堿由甘氨酸和3個甲基基團組成，主要存在于蝦、甜菜和全谷物等食物中[1]，也可由體內的膽堿經膽堿脫氫酶介導氧化而來。大多數研究認為，甜菜堿是甲基的可靠來源，可替代膽堿和蛋氨酸在動物營養中的作用[2]。作為一種有機滲透劑，甜菜堿在大多數組織中蓄積，可改善宿主的腸道功能[3]。甜菜堿在轉甲基化反應中通過提供甲基增加肌酸生成，可保護新生兒大腦免受分娩引起的缺氧[4]；在細胞初始分裂時作為滲透保護劑，在囊胚中作為甲基供體，對胚胎發揮有益作用[5]。

哺乳動物的胃腸道中棲息著復雜多樣的腸道菌群，可參與宿主的營養代謝、免疫反應和生長發育[6]。另外，腸道菌群的代謝產物可作為腸道細胞的能量底物，在機體中發揮抗炎作用[7]。有研究發現，宿主不同生理狀態、合生元添加或飲食成分改變等均會影響腸道微生物的群落結構[8]。妊娠-哺乳期飼糧添加合生元可顯著改善母豬的脂質代謝，增加妊娠后期腸道菌群多樣性和柔膜菌門(Tenericutes)相對豐度，這有利于緩解機體妊娠期炎癥，促進胎兒的健康發育[9]。筆者前期研究發現，飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽可顯著增加巴馬香豬初乳中乳蛋白含量，改善其血漿代謝產物含量，增加斷奶仔豬數量[10]。但是，腸道菌群是否介導了甜菜堿鹽酸鹽的上述作用仍不清楚。因此，本文進一步研究了妊娠-哺乳期飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽對巴馬香豬糞便菌群組成及其代謝產物含量的影響，為其在母豬生產中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養管理

動物飼養試驗于2018年8月至2019年2月在湖南省常德市石門縣漢唐農業有限公司豬場開展。選取3～7胎次剛配種的巴馬香豬40頭，隨機分為2組，每組20頭，單欄飼養，分娩前1周轉至產房。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組在基礎飼糧中添加3.5 kg/t甜菜堿鹽酸鹽(純度為95%)。母豬配種后飼喂妊娠母豬飼糧，妊娠第105天至斷奶飼喂哺乳母豬飼糧。基礎飼糧營養水平參照我國《豬飼養標準》(NY/T 65—2004)，預混料參照NRC(2012)母豬營養需求，基礎飼糧組成及營養水平同高乾坤等[10]。試驗期為母豬配種后第3天至分娩后第21天。對照組中，3、4、5、6和7胎次的母豬分別有6、3、5、4和2頭；試驗組中，3、4、5、6和7胎次的母豬分別有5、4、4、4和3頭。試驗期間，對照組母豬返情4頭，正常分娩16頭；試驗組母豬返情4頭，流產1頭，正常分娩15頭。其他飼養管理均按商業養豬場規范操作。

1.2 樣品采集與處理

分別于母豬妊娠第105天和哺乳第21天采集母豬新鮮糞便樣品，-20 ℃保存，用于微生物測序及其代謝產物含量測定。

1.3 母豬糞便微生物DNA提取與16S rDNA測序

將糞便樣品解凍，均勻混合后取0.200 0 g左右，根據Fast DNA SPIN Extraction Kits(MP Biomedicals公司，美國)說明書抽提糞便總DNA，利用NanoDrop 1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司，美國)檢測DNA濃度和純度；用338F(5’-GCACCTAAYTGGGYDTAAAGNG-3’)和806R(5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’)引物對V3～V4可變區進行PCR擴增，擴增程序為：98 ℃預變性2 min，25個循環(98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸5 min。擴增體系為25 μL：5 μL 5×緩沖液，5 μL 5×High-Fidelity GC緩沖液，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，1 μL上、下游引物(10 μmol/L)，0.25 μL High-Fidelity DNA聚合酶(5 U/μL)，2 μL DNA模板，8.75 μL ddH2O。PCR擴增片段利用Agencourt AMPure Beads(Beckman Coulter公司，美國)純化和PicoGreen dsDNA試劑盒(Invitrogen公司，美國)定量，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR擴增結果，于Illumina MiSeq平臺進行雙端測序(2×300 bp，上海派森諾有限公司)。

1.4 母豬糞便代謝產物含量測定

準確稱取糞便樣品，利用氣相色譜儀(Agilent公司，7890A，美國)測定其中短鏈脂肪酸(SCFA，包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸)含量[11]，利用高效液相色譜儀(Agilent公司，1260，美國)分析生物胺(包括色胺、腐胺、尸胺、酪胺和亞精胺)、吲哚和糞臭素含量[11]。

1.5 生物信息學與差異顯著性分析

將測序得到的PE reads進行去引物、質量過濾和拼接。利用QIIME軟件調用UCLUS序列比對工具對質控后得到的有效序列在97%序列相似度下聚類，得到操作分類單元(OTU)代表序列，并將其與GreenGene數據庫(http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)[12]的模板序列相比對，獲取每個OTU對應的分類學信息。基于以上獲得的OTU信息，調用QIIME軟件alpha_diversity.py命令分析樣品的alpha多樣性指數，即ACE、Chao1、Shannon和Simpson指數；并在門和屬水平上聚類分析樣品物種組成和相對豐度。利用PICRUSt軟件對糞便微生物群落進行功能預測，通過KEGG Pathway菌群豐度分析，篩選具有顯著差異功能的糞便菌群。

試驗數據用Excel 2010初步整理后，利用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，數據以“平均值±標準誤”表示。利用Metastats軟件(http://metastats.cbcb.umd.edu/)分析腸道微生物相對豐度變化，利用R軟件ggplot2和pheatmap程序以及GraphPad Prism V.7.0軟件作圖。P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有變化趨勢。

2 結 果

2.1 母豬糞便微生物多樣性的變化

由表1可知，與對照組相比，飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽顯著增加了哺乳第21天母豬糞便微生物Chao1和ACE指數(P<0.05)。由圖1可知，甜菜堿鹽酸鹽組與對照組母豬糞便菌群結構明顯聚成兩大類群。

表1 妊娠-哺乳期飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽對母豬糞便微生物alpha多樣性的影響Table 1 Effects of dietary betaine hydrochloride supplementation on fecal microbiota alpha diversity of sows during pregnancy and lactation

B105：妊娠第105天甜菜堿鹽酸鹽組 Betaine hydrochloride group of day 105 of pregnancy；C105：妊娠第105天對照組 Control group of day 105 of pregnancy；BL21：哺乳第21天甜菜堿鹽酸鹽組 Betaine hydrochloride group of day 21 of lactation；CL21：哺乳第21天對照組 Control group of day 21 of lactation。

2.2 母豬糞便微生物組成的變化

由圖2可知，厚壁菌門、擬桿菌門、密螺旋體門和疣微菌門為妊娠期母豬糞便菌群的主要優勢菌門(圖2-A)，密螺旋體屬、鏈球菌屬、乳酸菌屬和普氏菌屬為妊娠期母豬糞便菌群的主要優勢菌屬(圖2-B)。厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門和變形菌門為哺乳期母豬糞便菌群的主要優勢菌門(圖2-C)，密螺旋體屬、普氏菌屬、乳酸菌屬和草螺旋菌屬為哺乳期母豬糞便菌群的主要優勢菌屬(圖2-D)。

2.3 母豬糞便的差異菌群

由圖3可知，與對照組相比，妊娠第105天時，飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽顯著增加了迷蹤菌門和糞芽孢菌屬相對豐度(P<0.05)，顯著降低了放線菌門、未分類的酸桿菌門、貪銅菌屬、多爾氏菌屬和互養菌屬相對豐度(P<0.05)。由圖4可知，與對照組相比，哺乳第21天時，飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽顯著增加了不動桿菌屬、厭氧原體屬、優桿菌屬、短波單胞菌、草螺旋菌屬、假單胞菌屬、八聯球菌屬、假平胞菌屬、寡養單胞菌和變形菌門相對豐度(P<0.05)，顯著降低了貪銅菌屬、考拉桿菌屬、Sphaerochaeta和鞘氨醇桿菌相對豐度(P<0.05)。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Spirochaetes：螺旋體門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍藻菌門；Proteobacteria：變形菌門；Tenericutes：柔膜菌門；Fibrobacteres：纖維桿菌門；Elusimicrobia：迷蹤菌門；Synergistetes：未分類的酸桿菌門；Euryarchaeota：廣古菌門；Lentisphaerae：黏膠球形菌門；Treponema：密螺旋體屬；Streptococcus：鏈球菌屬；Lactobacillus：乳酸菌屬；Prevotella：普式菌屬；Oscillospira：顫螺菌屬；Ruminococcus：瘤胃球菌屬； Coprococcus：糞球菌屬；Clostridium：梭菌屬；Fibrobacter：纖維桿菌屬；Parabacteroides：副桿菌屬； [Prevotella]：未分類的普氏菌屬；Akkermansia：阿克曼菌屬；Dorea：多爾氏菌屬；Turicibacter：蘇黎世桿菌屬；Herbaspirillum：草螺菌屬；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Others：其他菌屬。

2.4 母豬糞便代謝產物含量的變化

由表2可知，與對照組相比，甜菜堿鹽酸鹽組母豬妊娠第105天糞便中尸胺含量顯著增加(P<0.05)，糞便中乙酸(P=0.054)、直鏈脂肪酸(P=0.075)和總SCFA(P=0.09)含量呈升高趨勢；哺乳第21天糞便中腐胺、亞精胺和糞臭素含量顯著增加(P<0.05)。

表2 妊娠-哺乳期飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽對母豬糞便代謝產物含量的影響Table 2 Effects of dietary betaine hydrochloride supplementation on fecal metabolite contents of sows during pregnancy and lactation

2.5 母豬糞便差異菌群與糞便代謝產物的相關性

由圖5可知，皮爾曼相關性分析發現，糞便假平胞菌屬、短波單胞菌、寡養單胞菌、不動桿菌屬、厭氧原體屬、變形菌門和草螺旋菌屬相對豐度與亞精胺含量呈顯著正相關(P<0.05)，寡養單胞菌、不動桿菌屬、變形菌門、草螺旋菌屬、假單胞菌屬和優桿菌屬相對豐度與腐胺含量呈顯著正相關(P<0.05)，厭氧原體屬相對豐度與異戊酸和異丁酸含量呈顯著負相關(P<0.05)。

p_Elusimicrobia：迷蹤菌門；p_Actinobacteria：放線菌門；p_Synergistetes：未分類的酸桿菌門；g_Synergistes：互養菌屬；g_Coprobacillus：糞芽孢菌屬；g_Cupriavidus：貪銅菌屬；g_Dorea：多爾氏菌屬。

2.6 母豬糞便微生物功能預測

由圖6可知，與對照組相比，飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽后，妊娠第105天母豬糞便微生物有3條通路顯著富集，即核苷酸代謝、糖生物合成與代謝和酶家族；哺乳第21天母豬糞便微生物有4條通路顯著富集，即異生素生物降解和代謝、萜類和多酮類代謝、其他氨基酸代謝和脂代謝。

3 討 論

微生物多樣性對于維持腸道微生物群落的穩定和改善宿主的健康狀況起著至關重要的作用，微生物多樣性降低，提示宿主腸道菌群發生紊亂[13]。Chen等[14]研究發現，甜菜堿鹽酸鹽可顯著增加急性肝功能衰竭小鼠的腸道菌群多樣性，緩解機體炎癥。本研究發現，飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽增加了哺乳第21天母豬糞便菌群alpha多樣性，提示甜菜堿鹽酸鹽可改善哺乳期母豬的腸道健康，有助于維持其正常泌乳活動。此外，妊娠-哺乳期間母豬糞便菌群結構發生了顯著變化，提示腸道微生物組成可能與妊娠與分娩期間的機體代謝有關。

現有研究發現，厚壁菌門和擬桿菌門是妊娠-哺乳期母豬的優勢菌門[4]，與本研究結果一致。基因組研究表明，一些屬于迷蹤菌門的菌群可發酵葡萄糖[15]，其相對豐度增加可促進玉米秸稈釋放出更多的含糖物質[16]。由普雷沃氏菌科和糞球菌屬產生的SCFA可增加杯狀細胞數量，防止毒素入侵宿主[17]。本研究中，飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽顯著增了妊娠第105天母豬糞便迷蹤菌門和糞球菌屬相對豐度，提示甜菜堿鹽酸鹽可通過影響腸道菌群結構來改善其糖脂代謝，增強機體免疫功能。厭氧原體屬作為微生物區系中的關鍵抗炎成分[18]，可通過調節轉化生長因子-β(TGF-β)和免疫球蛋白A(IgA)的產生預防腸道炎癥[19]。在本研究中，飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽顯著增加了哺乳第21天母豬糞便厭氧原體屬相對豐度，提示甜菜堿鹽酸鹽可能通過增加機體腸道菌群相對豐度改善哺乳引發的機體炎癥。

p_Proteobacteria：變形菌門；g_Acinetobacter：不動桿菌屬；g_Herbaspirillum：草螺旋菌屬；g_Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；g_Sphingomonas：假平胞菌屬；g_Stenotrophpmonas：寡養單胞菌；g_Anaeroplasma：厭氧原體屬；g_Sarcina：八聯球菌屬；g_Pseudomonas：假單胞菌屬；g_Brevundimonas：短波單胞菌；g_Anaerovorax：優桿菌屬；g_Sphingobacterium：鞘氨醇桿菌。

SCFA主要由細菌發酵膳食纖維產生，隨后被宿主血液吸收，對腸道功能、炎癥和宿主健康起著至關重要的作用[20]。其中，乙酸可為宿主腸道菌群和腸上皮細胞提供能量；丁酸作為維持機體腸道健康及其完整性的重要物質，可為腸上皮細胞的增殖分化提供60%～70%的能量[21]；戊酸可參與抑制機體結腸癌細胞的生長，緩解機體腸道炎癥[22]。本研究中，飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽有增加妊娠后期母豬糞便中乙酸、直鏈脂肪酸和總SCFA含量的趨勢，提示甜菜堿鹽酸鹽可能通過調節營養物質代謝來維持其腸道健康；飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽顯著降低了哺乳后期母豬糞便中丁酸含量，且有降低戊酸含量的趨勢，提示甜菜堿鹽酸鹽可通過為母豬提供能量滿足哺乳仔豬的能量需要。

生物胺由機體結腸微生物發酵含氮化合物產生。其中，腐胺是精胺和亞精胺的前體，均可調節胎盤的生長；精胺和亞精胺可參與調節機體核酸和蛋白質等大分子物質的合成，促進其腸道健康；賴氨酸在機體脫羧酶作用下可產生尸胺。本研究發現，飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽顯著增加了妊娠第105天母豬糞便中尸胺含量，可能與腸道微生物促進了賴氨酸的分解代謝有關；顯著增加了哺乳第21天母豬糞便中腐胺和亞精胺含量，提示甜菜堿鹽酸鹽可促進腸上皮細胞的增殖和維持其腸道健康[23]。

Sphingomonas：假平胞菌屬；Brevundimonas：短波單胞菌；Stenotrophpmonas：寡養單胞菌；Acinetobacter：不動桿菌屬；Anaeroplasma：厭氧原體屬；Sarcina：八聯球菌屬；Proteobacteria：變形菌門；Herbaspirillum：草螺旋菌屬；Actinobacteria：放線菌門；Pseudomonas：假單胞菌屬；Lactobacillus：乳酸菌屬；Anaerovorax：優桿菌屬；Cupriavidus：貪銅菌屬；Sphingobacterium：鞘氨醇桿菌屬；Dorea：多爾氏菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Acetate：乙酸；Propionate：丙酸；Butyrate：丁酸；Valerate：戊酸；Total SCFA：總短鏈脂肪酸；Isobutyrate：異丁酸；Isovalerate：異戊酸； Tryptamine：色胺；Putrescine：腐胺；Cadaverine：尸胺；Tyramine：酪胺；Spermidine：亞精胺；Indole：吲哚；Skatole：糞臭素。

動物腸道菌群可發酵小腸內未被消化吸收的蛋白質產生色氨酸，進一步降解產生吲哚和糞臭素等物質[24]。糞臭素可通過血液循環，經肝臟代謝隨尿液排出或者儲存于肌肉和脂肪組織[25]。宿主對蛋白質的消化利用越少，未被消化吸收的蛋白質進入后腸就越多，進而會產生較多的糞臭素。本研究發現，飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽可顯著降低產后第21天糞臭素含量，這有利于提高小腸對蛋白質的利用率，減少腸道內糞臭素的形成。

腐胺和亞精胺可參與調節機體代謝及蛋白質合成，且腐胺對緩解腸道炎癥具有重要作用。本研究通過腸道差異菌群與其代謝產物的關聯分析發現，糞便寡養單胞菌、不動桿菌屬、變形菌門和草螺旋體屬相對豐度與亞精胺和腐胺糧含量呈正相關，厭氧原體屬相對豐度與亞精胺、腐胺、異丁酸和異戊酸含量呈負相關。這提示甜菜堿鹽酸鹽參與了緩解機體炎癥及調控/激活宿主相關蛋白質酶的合成[26]，該作用可能是通過調節腸道菌群豐度和組成來實現的。有研究發現，甜菜堿鹽酸鹽可通過改善宿主腸道群落結構緩解機體炎癥[14]。

現有研究表明，一些來源于植物的萜類化合物和姜黃素具有很強的抗炎活性[27]。本研究發現，飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽可顯著上調妊娠第105天母豬糞便微生物中與核苷酸代謝、聚糖生物合成與代謝和酶家族相關的代謝通路，以及哺乳第21天母豬糞便微生物中與異生素生物降解和代謝、萜類和多酮類代謝、脂代謝和其他氨基酸代謝相關的代謝通路，這可能有利于緩解母豬的機體炎癥，改善母豬的脂蛋白代謝和能量消耗[28]。

4 結 論

妊娠-哺乳期飼糧添加甜菜堿鹽酸鹽改善了母豬的腸道菌群平衡及其代謝活性，上調了緩解機體炎癥及改善脂代謝的相關代謝通路，促進了機體健康。

Xenobiotics Biodegradation and Metabolism：異生素生物降解和代謝；Nucleotide Metabolism：核苷酸代謝；Metabolism of Terpenoids and Polyketides：萜類和多酮類代謝；Metabolism of Other Amino Acids：其他氨基酸代謝；Metabolism of Cofactors and Vitamins：輔酶因子和維生素代謝；Lipid Metabolism：脂代謝；Glycan Biosynthesis and Metabolism：糖生物合成與代謝；Enzyme Families：酶家族；Energy Metabolism：能量代謝；Carbohydrate Metabolite：碳水化合物代謝；Biosynthesis of Other Secondary Metabolites：其他次級代謝產物的合成；Amino Acid Metabolism：氨基酸代謝。