羅伊氏乳桿菌調節腸黏膜屏障功能的作用及機制

吳勝男 胡勝蘭 蔣宗勇 王 麗*

(1.廣東省農業科學院動物科學研究所，農業部華南動物營養與飼料重點實驗室，國家畜禽育種重點實驗室，嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，廣東省畜禽育種與營養重點實驗室，廣州 510640；2. 廣東海洋大學濱海農學院，湛江 524088)

20世紀80年代時，羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri，L.Reuteri)被誤認為發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum，L.fermentum)中的一種。后來由Kandler等[1]鑒定為新的菌種，并命名為“reuteri”。L.Reuteri普遍存在于自然環境中，已經可以從人、鼠、豬和雞等糞便中分離。一直以來，對于L.Reuteri的研究發現，其作為一種益生菌可以在腸道發揮有效作用，改善腸道健康、增強動物免疫能力、提高動物生長性能和有效保護腸道健康，且作為抗生素的潛在替代物應用于畜禽生產，但具體作用機制尚未明確。本文綜述了L.Reuteri的生物學特性，以及在腸道黏膜的機械/物理屏障、化學屏障、生物屏障和免疫屏障4個方面的作用機制及其對畜禽動物機體的影響，為L.Reuteri更好地應用于生產實際提供科學參考。

1 L. Reuteri的概述

L.Reuteri是一種過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性、不產芽孢、專性異型發酵細菌，能發酵己糖生成二氧化碳、乙酸、乙醇和DL-乳酸等產物。L.Reuteri耐胃酸和膽汁能力強，是少有的以消化道作為天然寄居地的益生菌，動物出生后就能在其腸道定植[2]。作為腸道菌群中的一員，起著維護腸道微生物菌群結構的穩定、增強機體對疫苗的應答[3]、預防胃腸道感染等重要作用。王志林等[4]從健康的斷奶仔豬糞便中分離出豬源L.Reuteri，體內試驗發現，L.Reuteri可提高斷奶仔豬采食量、平均日增重(ADG)，降低料重比，提高飼料養分消化率，降低血清尿素氮含量，還可以降低腹瀉率[5]。有研究發現，L.ReuteriLR1可以改善斷奶仔豬的生長性能和腸道形態[6]。此外，L.Reuteri可以提高家禽的生長性能[7]，增加雞的體重，提高免疫功能[8]。

2 腸黏膜屏障

腸道是動物機體最大的器官，主要作用是消化和吸收飼料中的營養成分。腸道管壁將機體內組織與外界環境隔開，管壁上的黏膜層像一道屏障一樣，防止腸腔中有毒物質和致病微生物入侵，因此完整的腸黏膜形態結構是保證腸道發揮一切正常生理功能的重要前提。一般可將腸黏膜屏障劃分為機械/物理屏障、化學屏障、生物屏障和免疫屏障[9-10]。它們之間互相聯系，共同維持腸道的完整性和穩定性[11]。

2.1 物理屏障

腸道的物理屏障是由黏液層和腸上皮細胞(intestinal epithelial cells，IECs)共同組成的，又稱黏膜機械屏障[12]。黏液層是上皮細胞和腸腔內環境物質交換的媒介，限制細菌與腸上皮細胞接觸，也為菌群提供營養和黏附位點，是機械屏障中不可或缺的組成部分。黏蛋白由黏液素1、黏液素2等組成，還含有分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)，可有效抵御病原菌的侵入，黏液潤滑腸壁，隔絕病原菌和腸上皮細胞，保護上皮細胞免受損傷[13]。黏液層下是上皮細胞，其間隙之間有緊密連接蛋白(tight junctions，TJs)結構。TJs一旦受損，上皮細胞間的通透性就會增高，有害物質經過腸黏膜和上皮細胞間進入體循環，引起腸道感染及全身性反應。黏膜的機械屏障阻斷腸腔內的細菌位移，減少腸腔內細菌與宿主炎性免疫細胞相互作用。

2.2 化學屏障

腸黏膜化學屏障是由胃腸道分泌的消化液、溶菌酶、糖蛋白、抗菌肽和腸道菌群產生短鏈脂肪酸等化學物質組成[14]。胃中的酸性環境能殺滅胃內的細菌，減少細菌在胃腸道黏附和定植。膽酸可以降解內毒素分子，防止被腸道吸收造成機體中毒。潘氏細胞分泌的防御素是廣譜的抗菌物質。溶菌酶可破壞細菌細胞壁使其裂解，黏液中的補體成分可增強溶菌酶和免疫球蛋白的抗菌作用。這些化學物質都成了防止細菌毒素擴散的化學屏障。

2.3 生物屏障

黏膜生物屏障即腸道正常菌群[15]，它們通過磷壁酸與黏膜上皮細胞結合形成微生物膜，抑制有害菌的生長[16]。正常菌群在不破壞上皮細胞的基礎上定植于腸道表面，形成一道生物屏障[17]。腸道各菌群之間存在相互依賴和相互制約的關系，共同維持腸道蠕動。優勢菌群對宿主發揮生理作用，占據黏膜的深層，地位相當穩固，又稱益生菌[18]。如乳酸桿菌通過可競爭性占位抑制腸道條件致病菌，提高益生菌群比例，維持腸道微生態穩定[19]。同時，乳酸桿菌產生乳酸(lactic acid，LA)等物質，改變pH，增加腸道內有益菌群的數量[20]。此外，腸黏膜的生物屏障與致病菌競爭營養物質，使機體產生非特異性抗體和激活吞噬細胞活性，以阻止細菌侵襲。

2.4 免疫屏障

腸道黏膜內含有大量淋巴組織，能夠產生大量的抗體。腸黏膜免疫屏障是腸道相關淋巴組織(gut associated lymphoid tissue，GALT)及其所分泌的sIgA和細胞因子所組成的免疫屏障[21]。彌散性淋巴細胞和組織樣淋巴組織形成了GALT，前者主要是散在黏膜固有層及上皮細胞層內的淋巴細胞及腔內淋巴細胞，后者主要是派爾集合淋巴結、腸系膜淋巴結及孤立淋巴細胞。GALT主要分布在淋巴結、固有層和腸上皮細胞間，具有鄰近各種抗原的特點。固有層內有大量的淋巴細胞，包括巨噬細胞、自然殺傷(natural killer，NK)細胞、淋巴因子激活的殺傷(lymphokine-activated killer，LAK)細胞和肥大細胞。另外，在黏膜淋巴結的濾泡相關上皮中有一種M細胞，表面的褶皺可協助抗原快速轉運，是腸道細菌和其他抗原物質至基底淋巴細胞組織發生免疫反應的門戶[22]。

3 L. Reuteri對腸黏膜屏障的調節作用

3.1 L. Reuteri對物理屏障的調節作用

3.1.1 促進黏蛋白分泌，增加黏液層厚度

3.1.2 促進腸細胞增殖

腸上皮細胞增殖與凋亡的平衡維持著機械屏障的動態平衡。L.Reuteri可暫時性地激活原代腸上皮細胞并促進腸上皮細胞遷移和增殖，使它們快速周轉；而細胞快速周轉是針對侵襲性細菌、寄生蟲和病毒的宿主防御機制，用于排除來自上皮的感染細胞和病原體。研究表明，L.ReuteriLET 210能減少體內含有麥胚凝集素的雞腸道上皮細胞的死亡[28]。L.Reuteri通過提高小鼠結腸中的富含亮氨酸重復單位的G蛋白偶聯受體5的轉錄水平來促進損傷后結腸的干細胞生成，加快腸道隱窩細胞的增殖[29]。對于感染了輪狀病毒的新生小鼠，L.Reuteri17938能增加其腸道絨毛高度，促進腸細胞增殖[30]。

3.1.3 提高緊密連接蛋白表達量

緊密連接通過緊密連接蛋白-1(ZO-1)與跨膜蛋白的相互作用，在維持膜屏障功能和完整性方面發揮重要作用。L.ReuteriLR1能防止IPEC-1細胞由于腸毒性大腸桿菌ETECK88感染引起的ZO-1破壞。L.ReuteriLR1還存在TLR2信號傳導途徑，即乳桿菌的細胞壁成分——脂肪酸磷酸通過蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活來增強ZO-1相關腸上皮屏障的完整性[31]。Yang等[32]發現L.ReuteriI5007能防止脂多糖誘導的腸道緊密連接蛋白表達降低，顯著提高小鼠空腸和回腸上皮閉合蛋白-1(Claudin-1)、閉鎖蛋白(Occludin)和ZO-1的蛋白表達量。此外，L.Reuteri能阻止IPEC-J2細胞中腸毒素性大腸桿菌誘導的細胞活力和跨膜電阻(TEER)值降低和緊密連接蛋白的破壞，從而保護腸道屏障[33]。

3.2 L. Reuteri對化學屏障的調節作用

3.2.1 降低腸道pH

L.Reuteri通過共凝聚作用降低pH和過氧化氫含量，顯著抑制真菌和大腸桿菌等有害菌的生長，促進腸道菌群平衡來維持腸道健康[34]。另外，L.Reuteri使腸道中揮發性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)的合成增強[35]，降低腸道pH。L.ReuteriI5007將大腸中的葡萄糖酸(gluconic acid，GA)發酵成丁酸(butyric acid，BA)，增加結腸內容物中BA和回腸LA的含量[20]，VFA還能給上皮細胞提供能量，改變細菌細胞膜的通透性來抑制致病菌的生長。

3.2.2 增加防御肽的表達

L.Reuteri通過增加結腸內容物中短鏈脂肪酸的含量以及結腸短鏈脂肪酸受體發揮作用，從而促進腸上皮細胞中防御肽的表達。L.Reuteri促進空腸中防御素(pBD)-2和結腸中pBD-2、pBD-3、pBD-114和pBD-129 mRNA相對表達量[36]，顯著改善腸道黏膜的免疫功能。L.Reuteri可通過改變蛋白質的結合位點，從而改變其他菌株的黏附特性，例如，L.ReuteriDSM20016來源的生物表面活性劑是變形鏈球菌ATCC35668中葡糖基轉移酶和果糖基轉移酶的有效抑制劑，通過下調其中黏附腸道的3種關鍵基因水溶性葡聚糖(gtfB)、水溶性和不溶性葡聚糖(gtfC)、細胞核受體(ftf)的表達，抑制變形鏈球菌ATCC35668在腸道的定植[37]。

3.2.3 調節血清中化學物質

L.ReuteriDSM 17938上調與尿素循環、三羧酸循環、蛋氨酸甲基化和多胺途徑有關的血漿代謝產物，并且通過增加小鼠體內色氨酸代謝物和嘌呤核苷腺苷的水平來增強對炎癥刺激的耐受性。N-乙酰鳥氨酸是腸道谷氨酰胺和谷氨酸合成微生物瓜氨酸和精氨酸途徑的中間物質。L.ReuteriDSM 17938可提高N-乙酰鳥氨酸的含量，它是腸道谷氨酰胺和谷氨酸合成微生物瓜氨酸和精氨酸途徑的中間物質。大多數哺乳動物的腸上皮細胞可以從谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸生成瓜氨酸，而瓜氨酸在肝臟外組織中被轉化為精氨酸。血清中瓜氨酸含量升高，精氨酸的內源性產量也隨之增加，促進肌肉蛋白質合成，谷氨酰胺和精氨酸對腸黏膜的完整性和恢復至關重要[38]。

3.3 L. Reuteri對生物屏障的調節作用

3.3.1 調節腸道菌群

作為腸道內的優勢菌群，L.Reuteri在幼年動物腸道內定植，與病原菌競爭營養物質，菌體與其他有益菌的黏附組成腸上皮的生物屏障，通過空間障礙、競爭性抑制靶向細胞上的附著位點或者微菌落擴散共同抵御病原菌的侵襲。經證實，L.Reuteri具有抑制幽門螺氏桿菌(Helicobacterpylori，HP)與糖脂受體的結合，阻止Asialo-GM1和硫酸酯(sufonic acidester，SA)的結合[39]，抑制病原菌與腸道上皮細胞的結合。相反，L.Reuteri促進分段絲狀細菌(segmented filamentous bacteria，SFB)在腸道的生長。在小鼠體內，SFB誘導強烈的免疫球蛋白A(IgA)反應和固有層CD4+的募集和激活，影響T細胞與上皮內CD8+T淋巴細胞的數量，在腸先天免疫的成熟過程中起著關鍵作用[38]。所以，L.Reuteri喂養母鼠會增加子鼠腸道中有益菌數量，調節性T細胞的百分比隨之增大。在斷奶仔豬飼糧中加入L.Reuteri能增加糞便中小桿菌屬和光桿菌屬細菌的豐度[40]。L.Reuteri不僅能產生抑菌物質，還可以增強其他益生菌產生抑菌物質的能力。當L.ReuteriKLDS1.0736與植物乳桿菌KLDS1.0391共培養時，與單獨培養時相比，抑菌圈直徑和細菌素合成量顯著增加，抑菌活性也有所增強[41]。

3.3.2 產生黏附素

L.Reuteri的黏附作用是通過菌體表面分泌的一種蛋白質或糖蛋白——黏附素(adhesin)與宿主黏液層或上皮細胞受體之間相互作用完成的。不同菌株的L.Reuteri產生的黏附素也不同，L.ReuteriNCIB 11951產生的黏附素為膠原結合蛋白[42]，L.Reuteri1063產生的黏附素為麥芽糖結合蛋白[43]，L.Reuteri100-23產生的黏附素為高分子質量表面蛋白[44]。這些黏附素可以促進包括L.Reuteri等有益菌在腸道的定植。

3.3.3 獨特的生物活性

L.Reuteri獨特之處在于它能產生一種非蛋白質類廣譜活性的抑菌物質羅伊氏菌素，能抑制埃希氏菌、沙門氏菌和志賀氏菌等細菌的生長，當其濃度達到15～30 μg/mL時，抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，甚至酵母菌、真菌和原生動物的生長[3]。L.Reuteri還能產生Reutericin 6、Reutericyclin、胞外多糖等抑菌物質，Reutericyclin是一種廣譜的抗菌物質[45]。

3.4 L. Reuteri對免疫屏障的調節作用

3.4.1 細菌酶的“抗組胺”作用

L.Reuteri有抗組胺的作用，通過減少PKC介導的哺乳動物細胞信號來抑制腸道1型組胺介導的促炎反應。L.Reuteri分泌一種細菌酶——二酰基甘油激酶(diacylglycerol kinases，DGK)，與腸道脂代謝關系密切，將哺乳動物的磷酸二酰基甘油(diacylglycerol，DAG)轉化為磷脂(phosphatidic acid，PA)。DGK抑制1型組胺受體下游PKC的磷酸化，由L.Reuteri6475分泌的DGK可能與上皮DAG脂質信號相互作用，從而抑制促炎1型組胺受體，激活抗炎組胺2型受體信號傳導。最終，PKC磷酸化水平的降低可能減弱核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號轉導和抑制黏膜炎癥從而維護腸道免疫穩態[46]。

3.4.2 增強巨噬細胞吞噬作用

巨噬細胞作為天然免疫和適應性免疫的重要組成部分，能在短時間內吞噬和清除大部分入侵的病原體。巨噬細胞通過產生一氧化氮和活性氧等效應物，以及分泌促炎細胞因子，誘導炎癥和細胞毒性來防止病原體的入侵。一氧化氮是重要的內部和細胞間調節分子，殺死病毒感染的細胞、腫瘤細胞和寄生性病原體，且在某些病毒感染中有抗病毒作用[47]，被認為是先天防御機制的第2道防線。巨噬細胞在炎癥反應中誘導產生一氧化氮合酶，導致感染后一氧化氮含量升高[48]。L.Reuteri通過參與激活巨噬細胞，增強其吞噬能力和殺死細胞內細菌的能力，同時促進感染鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium，ST)小鼠的巨噬細胞中一氧化氮的分泌，進而加強了L.Reuteri對ST感染的小鼠的保護作用，并減少小鼠體內的細菌負荷，加強腸黏膜的免疫功能[49]。

3.4.3 參與調控炎癥反應

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是天然免疫細胞和其他細胞或組織表面最重要的模式識別受體，腸道的先天性免疫和適應性免疫依靠其完成[50]。TLR介導的NF-κB信號轉導和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉導是調節由刺激觸發的宿主炎癥的重要途徑。NF-κB在免疫和炎癥反應中具有重要作用，NF-κB的失調可導致促炎性細胞因子過度生成，微生物已經被證實具有調節NF-κB信號通路活性的能力。L.Reuteri可以分泌γ-谷氨酰半胱氨酸，γ-谷氨酰半胱氨酸可進入腸上皮細胞并調節上皮細胞因子的產生，它通過抑制活性氧和NF-κB起作用，減少白細胞介素(IL)-8的產生[51]。L.Reuteri對免疫反應具有積極作用，使用低劑量就能提高T淋巴細胞數量和IL-12水平。L.ReuteriDSM 17938和ATCCPTA 4659通過下調TLR4的表達，降低NF-κB的轉錄，從而抑制試驗性腸炎癥反應[52]。革蘭氏陽性菌細胞壁的肽聚糖會被TLR2識別，TLR2的激活可以促進促炎和抗炎細胞因子，研究表明，L.ReuteriDSM17938通過激活TLR2，進而發揮對壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)的保護作用[53]。

3.4.4 參與調控T細胞

Treg的免疫抑制機制包括細胞因子依賴性和非依賴性途徑。在細胞因子依賴性途徑中，IL-10和TGF-β是抑制過度免疫反應的主要細胞因子。L.Reuteri是一種功能性益生菌，能夠誘導針對食物過敏的腸道免疫耐受。研究表明，腸分泌IL-10的CD103+DCs和功能性Treg細胞是由L.Reuteri誘導的，這可能維持免疫耐受并抵消異常的免疫反應[54]。Hoang等[53]研究發現，L.ReuteriDSM 17938可改善NEC的癥狀和降低其發病率，并增加腸道黏膜中TregCD4+FOXP3+的百分比。在之后的研究中，Hoang等[55]發現L.ReuteriDSM 17938可以通過增加腸道黏膜中Treg的數量，減輕NEC的嚴重程度和降低其發生率。TGF-β下調單核細胞與巨噬細胞中一些炎性細胞因子的表達，在誘導CD4+T細胞向誘導性免疫調節T細胞轉變時發揮重要作用，而L.ReuteriLR1提高斷奶仔豬回腸中IL-22和TGF-β的表達[5]。

4 小 結

綜上所述，L.Reuteri具有很好地保護和改善腸道屏障功能的作用，是通過影響微生物之間的關系、黏液層厚度、腸上皮細胞及之間的緊密連接蛋白、有機酸和抗菌肽的產生、免疫相關因子和免疫細胞來發揮作用(圖1)。研究L.Reuteri與腸道屏障之間的關系對動物乃至人類健康具有重要意義。以往的研究主要從分子和細胞水平闡述L.Reuteri調節腸道屏障的機制，而近年來流行的基因組學、蛋白質組學和代謝組學手段或更有助于更全面地解析復雜的體內環境下L.Reuteri的作用機制。由于L.Reuteri具有預防和減輕腹瀉、調節腸道微生物和免疫功能，在飼料抗生素禁用的環境下，作為畜禽生產中的一種有效飼料添加劑應用前景廣闊。

Intestinal mucosal immune barrier:腸黏膜免疫屏障；Intestinal mucosa physical barrier:腸黏膜物理屏障；Intestinal mucosa biological barrier:腸黏膜生物屏障；Intestinal mucosa chemical barrier:腸黏膜化學屏障；Intestinal mucosa:腸黏膜；Epithelial cell:上皮細胞；Lamina propria:固有層；Goblet cell:杯狀細胞；Crypt cell:隱窩細胞；Stem cell:干細胞；Intestinal villi:腸道絨毛；Defensin:防御素；H2O2:過氧化氫；ST：鼠傷寒沙門氏菌 Salmonella typhimurium；M?：巨噬細胞 macrophages；iNOS：一氧化氮合成酶 nitric oxide synthase；NO：一氧化氮 nitric oxide；DGK：二酰基甘油激酶 diacylglycerol kinases；PKC：蛋白激酶C protein kinase C；H1：1型組胺 histamine 1；H1R：促炎1型組胺受體 proinflammatory type 1 histamine receptor；H2R：抗炎組胺2型受體 anti-inflammatory histamine type 2 receptor；NF-κB：核因子-κB nuclear factor-kappa B；ROS：活性氧 reactive oxygen species；IL-8：白細胞介素-8 interleukin-8；IL-10：白細胞介素-10 interleukin-10；IL-12：白細胞介素-12 interleukin-12；Treg：調節性T細胞 regulatory T cells；TLR2：Toll樣受體2 Toll-like receptor 2；TLR4：Toll樣受體4 Toll-like receptor 4；Mucus：黏液；Muc2：黏蛋白2；PA：磷脂 hosphatidic；PKC：蛋白激酶C protein kinase C；TJ：緊密連接蛋白 tight junction protein；Lgr5；糖蛋白激素受體5 glycoprotein hormone receptor 5；Reutericyclin：重環素；IgA：免疫球蛋白A immunoglobulin A；SFB：分段絲狀細菌 segmented filamentous bacteria；HP：幽門螺氏桿菌 helicobacter pylori；SA：硫酸酯 sufonic acidester； Ganglio-N-tetraosylceramide:甘利奧-N-四甲基神經酰胺；Reuterin：重子宮素；LA：乳酸 lactic acid；BA：丁酸 butyric acid；GA：葡萄糖酸 gluconic acid；VFAs：揮發性脂肪酸 volatile fatty acids；CD103+DCs：樹突狀細胞CD 103+子集；CD4+：CD4+T細胞。