煙酰胺調控圍產期奶牛氧化應激狀態的潛在機制

尹清艷 姚軍虎

(西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100)

奶牛圍產期包括圍產前期(產前3周)和圍產后期(產后3周)，是泌乳周期中重要的轉折期。奶牛此時面臨妊娠后期胎兒快速生長和產后泌乳啟動，營養和能量需求增加；激素水平也會隨生理快速轉變而變化，適應并調節機體的生理轉變過程，圍產期將面臨巨大挑戰[1-2]。精準營養調控有助于改善圍產期奶牛健康[3-4]。圍產前能量負平衡(negative energy balance，NEB)是主要生理特征之一，是奶牛免疫抑制、機體脂質代謝紊亂和氧化應激等誘因。為滿足母體和胎兒在圍產期營養需求，奶牛將動員自身體脂提供能量，體脂動員產生大量的游離脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFA)進入組織和器官供能；氧化供能過程中產生大量的氧自由基，超出機體清除能力時將處于氧化應激狀態。圍產期營養需要量增加而供給匱乏，抗氧化酶體系和非酶體系(硒、維生素A、維生素C、維生素E等)易受機體微量元素含量的影響，圍產期奶牛氧化應激與該時期營養供給和能量供應存在必然聯系。

1 圍產期氧化應激

氧化應激是機體內氧化系統和抗氧化系統的一種失衡狀態，氧化產物增加或抗氧化能力下降都將引發氧化應激。氧化應激發生與氧化產物生成(脂質氧化、氧化磷酸化和細胞有氧呼吸等過程)和抗氧化能力(抗氧化酶體系和非酶體系)等息息相關，圍產期奶牛糖脂代謝狀況見圖1，泌乳啟動后，大量葡萄糖用于乳糖合成，產后奶牛泌乳高峰期提早于采食量高峰期，將導致機體缺乏肝臟糖異生底物，糖異生能力降低是奶牛圍產期處于NEB因素之一[5]。圍產期NEB是奶牛機體脂質代謝紊亂、免疫抑制和氧化應激等的誘因。圍產期因特殊的生理需求和代謝，機體內的脂質代謝和能量供應等均發生變化，氧化產物生成受到以上代謝途徑的影響。

奶牛圍產期能量需求增加將加快肝臟糖異生和脂質動員過程，氧化產物生成使自由基產生，處于一種氧化應激狀態，氧化應激是機體代謝適應NEB狀態的結果[10]。奶牛通過動員體脂以滿足自身能量需求，緩解圍產期NEB，脂肪動員的結果是血液NEFA含量增加，隨著血液NEFA含量升高，奶牛外周血免疫球蛋白M合成下降，新陳代謝加快，將導致活性氧(reactive oxygen species，ROS)產量增加[11-12]。高NEFA含量可降低奶牛原代肝細胞抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)基因表達，增加丙二醛(MDA)和過氧化氫含量，加劇機體氧化應激[13]；NEB將導致奶牛體脂持續動員，機體將長期處于高代謝狀態[14]，機體持續脂質動員可誘發氧化應激發生[1]。機體處于氧化應激狀態可引發炎癥反應，嚴重時可損壞DNA，造成細胞凋亡[15]；妊娠、分娩和泌乳啟動相關的代謝將增加ROS的產生，ROS可引發脂質過氧化，造成組織細胞損傷[16-17]。機體產生ROS過量時，可上調氧化還原信號通路，進而影響炎癥因子表達，引發機體發生胰島素抵抗[18]。當體內抗氧化能力過強時，機體將處于還原應激，目前有關氧化還原穩態的評定還沒有明確的指標界定范圍[19]，有關氧化應激的探究處于相對水平的評價，尚無法實現絕對水平的評價。目前關于抗氧化能力的評價多基于單一抗氧化酶活性變化進行評估，單一抗氧酶活性變化無法呈現機體整體的抗氧化能力[20]，抗氧化酶活性之間的比值可輔助判斷機體清除自由基的能力[21]。氧化應激因氧化產物生成與清除不平衡所引起，使用抗氧化能力與氧化產物含量間的比值進行氧化應激評定可能更合理。未來有關氧化應激的研究應深入探討其相關指標間的絕對比值，以便于更好地評估氧化應激狀態。

TMR：全混合日糧 total mixed ration；RDS：瘤胃可降解淀粉 rumen degradable starch；peNDF：物理中性有效洗滌纖維 physical neutral effective washing fiber；VLDL：極低密度脂蛋白 very low density lipoprotein；NEFA：游離脂肪酸 non-esterified fatty acid；ROS：活性氧 reactive oxygen species。

氧化應激是奶牛圍產期多種疾病的誘因[22]；氧化應激與奶牛的酮病、乳房炎和胎衣不下等疾病相關[23-25]。圍產期高發疾病如乳房炎和子宮炎等均伴隨體溫升高[26]，但氧化應激發生無明顯的臨床表現，在動物生產易被忽視，奶牛圍產期的氧化應激是機體潛在的危害[9,27-28]，緩解圍產期的氧化應激可降低產后相關疾病發病率。添加抗氧化劑是目前生產中緩解氧化應激最常用的方式，已被證實具有抗氧化功能的添加劑包括維生素E、硒和蛋氨酸等。

圍產期氧化應激可通過外源添加營養素緩解，圍產期補飼15 g/d過瘤胃蛋氨酸或15 g/d過瘤胃膽堿可提高奶牛產后采食量和產后泌乳性能，同時可調節肝臟脂質代謝緩解NEB，進而改善抗氧化狀態及免疫功能[29]。煙酰胺(nicotinamide，NAM)作為輔酶Ⅰ煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)和輔酶Ⅱ煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADP+)的前體物質，已被證實可參與多條氧化應激通路，前期研究發現奶山羊圍產期補飼NAM(5 g/d)可調控糖脂代謝及能量供應，改善機體抗氧化功能，且母體的調控效應在子代中有所體現，改善子代的健康狀況[30-31]。NAM可改善圍產期的氧化應激狀態，下文將具體闡述其調控機理。

2 NAM緩解奶牛氧化應激的調控機理

2.1 調節糖代謝

奶牛能量供應的70%來自肝臟糖異生，圍產期糖異生作用減弱，能量供應不足，易引發氧化應激，緩解NEB可改善圍產期應激狀態[32]，增強糖異生途徑緩解圍產期NEB，可通過以下4種方式：1)外源提供糖異生底物；2)驅使瘤胃趨向丙酸型發酵；3)外源提供葡萄糖；4)提高內源能量供應效率。奶牛圍產期能量優先供給胎兒及泌乳，同時肝臟對胰島素的敏感性降低。圍產期多發生胰島素抵抗現象用于維持機體血糖平衡，分娩前后，高胰島素水平將干擾強氧化酶還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶4的信號傳遞，增加ROS生成。同時ROS通過促進葡萄糖轉運載體4(GLUT4)轉位到溶酶體，并誘導細胞應激途徑，促進胰島素抵抗，氧化應激與胰島素抵抗之間相互作用[33]。

圍產期奶牛外源添加NAM增加血漿葡萄糖濃度；奶牛血清代謝組學發現補充NAM(45 g/d)可通過調節氨基酸和碳水化合物等代謝途徑，促進氨基酸代謝，提高糖異生供能效率，進而改善機體氧化應激狀態[34-35]。NAM可作為NAD+和NADP+的前體物質發揮其生理功能。高濃度NAM處理大鼠試驗中發現，肝臟組織中煙酰胺磷酸核糖轉移酶、NAD+和沉默調節蛋白(SIRT)1、2、3、6 mRNA表達以及NAD+/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)比值、SIRT1活性均升高，進而增加輔激活因子1、增殖體激活受體和線粒體DNA表達水平，NAM可能通過改變線粒體生物功能調節葡萄糖代謝和NAD+-SIRT通路[36]。NAM可能通過調節線粒體功能、葡萄糖代謝和減緩胰島素抵抗等途徑緩解氧化應激。過氧化氫誘導的人皮膚成纖維細胞氧化應激模型中發現，NAM能保護糖酵解和氧化磷酸化，NAM通過加快糖酵解速率保護細胞代謝免受氧化應激的損傷，其保護機制可能與NAD+合成相關[37]。NAD+作為輔酶在氧化應激反應中發揮重要作用，氧化應激嚴重時將導致細胞核內聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶-1(PARP-1)過度活化，NAD+在此過程被消耗，導致凋亡誘導因子釋放。NAM是機體內合成NAD+的主要來源，在人原代角質細胞培養中加入煙酰胺磷酸核糖轉移酶的抑制劑(FK866)，NAM可緩解因此引起的糖酵解和氧化磷酸化[38]。補飼NAM可預防由于氧化應激造成的NAD+缺乏。

NAM通過調解葡萄糖代謝改善機體的能量供應，進而緩解氧化應激，奶牛圍產期NAM的補充可能通過加快線粒體代謝、氨基酸代謝、糖異生途徑等提高內源能量供應效率，提高內源葡萄糖的供能效率，緩解NEB。但線粒體氧化磷酸化供能過程中伴有超氧陰離子的泄露，NAM添加量增強此過程，因此導致的氧化產物累積是否將被動引發機體抗氧化能力的提升或超出機體的清除能力還需要進一步觀測和探討。

2.2 調節脂質代謝

脂肪組織動員產生甘油和NEFA可進入肝臟和其他組織供能，大量的NEFA進入肝臟代謝，少量的NEFA可被乳腺利用合成乳脂，脂肪酸可間接修飾細胞內的信號，改變脂質生物合成，誘導氧化應激，圍產期反芻動物維護肝臟健康有助于脂質代謝的調控[39]。奶牛原代肝細胞培養研究發現高濃度的NEFA可誘發酮病，增加肝細胞內ROS含量并誘導細胞氧化損傷，通過激活c-Jun N端激酶(c-jun N-terminal kinases，JNK)并抑制胞外信號調控激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)的表達，介導線粒體途徑ROS-JNK/ERK信號通路造成肝細胞凋亡[40]。NEFA進入肝臟可參與不同代謝途徑，可作為細胞器(內質網等)合成代謝途徑和線粒體氧化的能量底物[8]。線粒體中NEFA可減緩電子傳遞鏈中的電子流通量；作為能量底物參與β氧化過程，均可增加ROS生成[41-42]。

圍產期奶牛補飼煙酸可降低血漿NEFA含量，緩解NEB并提高初乳品質[43]。圍產期添加NAM(45 g/d)可調控奶牛脂質代謝；奶牛血清代謝組學發現補充NAM可通過碳水化合物和脂肪酸等代謝途徑，改善氧化應激狀態[34-35]。前期研究發現，NAM可通過代謝提高NAD+/NADH比值和誘導SIRT1活化實現線粒體自噬，促進細胞健康[44]。棕櫚酸酯誘導肝細胞內質網應激模型中，補充NAM可通過上調SIRT1緩解內質網應激，NAM抑制磷酸二酯酶(PDE)活性激活環磷酸腺苷/蛋白激酶A/環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cAMP/PKA/CREB)途徑刺激SIRT1活化，NAM可通過充當NAD+增強劑或SIRT1激活劑抗脂毒性[45-46]。NAM在線粒體功能及線粒體氧化磷酸化過程中均發揮一定作用，NAD+的補充可預防或逆轉非酒精性脂肪肝相關表型，如肝脂質蓄積和肝纖維化等，通過上調過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ)mRNA水平及其下游轉錄基因，線粒體激活和抗氧化能力增強或氧化磷酸化的繼發性作用導致脂肪生成基因的變化[47]。NAM抑制脂質氧化在醫學領域已被廣泛證明，圍產期補飼NAM可通過抑制脂肪組織的動員，減少NEFA的生成，緩解氧化應激。NAM可能通過調節線粒體功能、改變脂質代謝和氧化磷酸化水平緩解氧化應激潛在因素，其具體的機制需進一步探究。

2.3 參與氧化應激代謝通路

NAM是煙酸(維生素B3)的酰胺形式，分子式C6H6N2O，在體內來源于煙酸轉化和色氨酸轉化途徑補充。煙酸與NAM的生理作用存在差異，NAM作為NAD+和NADP+氧化還原組分，催化不同代謝過程的電子轉移，NAD+/NADH比值可作為監測氧化還原的敏感指標之一，影響線粒體的轉化通透性[48]。NADH是許多氧化還原反應中輔酶，氧化應激是機體內的綜合反映，細胞凋亡是氧化應激的主要特征之一，NAM與視黃醇協同可誘導ERK活化，阻滯氧化代謝和G0細胞周期[49]，NAM與線粒體功能和衰老相關[50]，依賴SIRT介導細胞凋亡，SIRT活性不足是NAD+水平降低的主要因素[51]，促進細胞衰老的p53基因乙?；捎蒒AD+依賴性的去乙?；窼IRT1調節，NAM不會增加肝臟NAD+或NADP+水平，但是通過飲食和NAM劑量依賴性的方式補充NAM可以增強某些SIRT1靶標的乙?；饔肹52]。同時NAM可通過維持細胞內鈣離子(Ca2+)水平和穩定線粒體膜電位，進而抑制細顆粒物(PM2.5)誘導的人原代角質細胞凋亡，同時可參與氧化應激通路，通過降低NADP/NADPH比值抑制ROS生成，并阻止氧化應激誘導的分子損傷(脂質過氧化、蛋白質羰基化和DNA修飾)[53]。NADPH是細胞質和線粒體抗氧化劑系統的主要電子供體，補飼NAM的高脂飲食喂養的小鼠肝臟中，NAM通過糖酵解和磷酸戊糖途徑(PP途徑)增強葡萄糖的攝取和糖原內部貯藏物的降解進而增加葡萄糖分解代謝。在肝細胞(HepG2)中，約50%的葡萄糖通過氧化磷酸化途徑被氧化，其余的作為乳酸排泄出去，通過PP途徑的葡萄糖量含量顯著提高。NAM對葡萄糖穩態調節進而改善細胞質氧化還原穩態，可能通過增加的PP途徑衍生的NADPH[52]。一氧化氮(nitric oxide，NO)作為活性氮簇的重要組成，是引發機體內氧化應激的因素之一，PARP-1可以直接通過結合到某些基因，如同種型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和趨化因子(chemokine，CXC)配體1的啟動子影響基因表達[54-55]，增加NO產量，引發氧化應激，NAM可能具有自身抗氧化特性或通過抑制PARP-1間接改善細胞氧化還原環境[56]。NAM具有傳遞氫的作用，可參與體內多條氧化應激通路，高劑量NAM保護細胞免受氧化應激的損害[57]。NAM對促進NAD+氧化還原平衡至關重要[48]，體外研究發現人纖維細胞添加NAM可顯著降低ROS產生[58]。氧化應激狀態是氧化產物含量與抗氧化酶的平衡狀態，許多病理模型中NAM均可通過降低氧化產物含量或提高抗氧化酶活性緩解氧化應激：NAM處理對乙酰氨基酚誘導大鼠肝臟損傷模型，可降低氧化產物MDA含量并提高CAT、GSH-Px活性[59]；阿爾茲海默癥大鼠注射NAM可降低MDA含量并提高CAT、SOD和GSH-Px活性[60]；妊娠期糖尿病大鼠補飼NAM可提高其抗氧化酶活性，進而緩解氧化應激[61]。

關于維生素B3在奶牛圍產期的應用，多以飼糧中補飼煙酸的形式進行探究[62-66]。NAM與煙酸在前期的研究中均表明具有提高圍產期抗氧化的作用(表1)。煙酸進入機體可轉化為NAM，二者部分作用功能相同，均可參與多種生化反應，如組織呼吸的氧化作用、脂質代謝和糖原分解等。但NAM進入不同組織轉化為NAD+的程度不一致[67]，目前關于檢測牛奶中NAD+含量的技術也有所關注[68]。NAM進入機體轉化為NAD+的程度和其過瘤胃效率還需要進一步檢測。在以往的研究中關于維生素B3的添加形式和添加劑量存在很大差別，過瘤胃煙酸的添加劑量甚至高于未經瘤胃保護的煙酸，維生素B3的應用形式及添加劑量還需進一步探索和規范。

表1 圍產期補飼煙酸或NAM對奶?？寡趸δ艿挠绊慣able 1 Effects of supplement of nicotinic acid or NAM on antioxidant function of dairy cows during transition period

3 小 結

圍產期是奶牛生產中非常重要的時期，包括自身健康和犢牛的生長發育狀況，此時期奶牛面臨巨大的生理變化、NEB、免疫抑制和氧化應激等因素，導致產后疾病高發，精準的營養調控有助于改善該時期的健康狀況。NAM可調控奶牛肝臟健康并緩解NEB，且在改善氧化應激狀態過程中發揮重要作用，其具體的添加形式及添加量需要進一步探討。未來的研究可集中于以下幾點：1)NAM形式及添加量的規范。基礎飼糧中精準其添加形式、過瘤胃效率和與煙酸的作用效果的區別。2)解析NAM調節肝臟代謝的信號通路。探討其作用于肝臟的關鍵信號通路，系統解析其具體的作用機理，以氧化磷酸化為核心出發點研究其調控機體氧化應激的作用途徑及機制。3)挖掘NAM在母子營養一體化中的潛力。進一步探討母體供應NAM對犢牛發育、生理代謝及健康狀況的調節，探究其潛在的作用及機制。