柑橘中手性柚皮素對映體的提取和拆分方法研究進展

姚周麟 吳韶輝 林 媚平新亮

（浙江省柑橘研究所 臺州 318026）

柚皮素（Naringenin，NAR）是一種天然的類黃酮物質，屬于二氫黃酮類，是柚皮苷（Naringin）的苷元，主要存在于蕓香科植物如葡萄柚、橙、佛手柑等柑橘類水果中。柚皮素在常溫下為白色針狀結晶，溶于乙醇、乙醚和苯等有機溶劑，幾乎不溶于水。柑橘中的柚皮素主要存在果皮中，如溫州蜜柑和紅美人的果皮中的柚皮素含量達 4.82、11.36 mg/kg[1]，果肉僅分別為0.09、0.20 mg/kg；李勛蘭等[2]研究了11種柑橘果肉的柚皮素含量也發現僅有 0.01～0.28 mg/kg。

柚皮素具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗腫瘤、解痙和利膽、預防和治療肝病、抑制血小板凝結、抗粥樣動脈硬化等多種藥理活性（圖1）。如柚皮素能減輕抗結核藥引起的大鼠肝腎損傷[3]；促進糖尿病大鼠中二甲雙胍的清除[4]；可作為 T細胞介導的自身免疫性炎癥疾病的預防/治療劑[5]和免疫相關疾病治療劑中潛在的免疫調節劑[6]；可減少I型糖尿病大鼠晶狀體的氧化應激標志物[7]，用于多種氧化應激疾病[8]；能有效抑制前列腺癌的轉移[9]；柚皮素納米制劑在預防和治療癌癥中有潛力[10]，和橙皮素聯合治療一種胰腺癌而不會引起對正常細胞的毒性[11]等，可被廣泛地應用于醫藥、食品等領域。本文綜述了柑橘柚皮素的提取與手性對映體拆分方法等方面的研究，并對手性柚皮素的研究方向進行了展望，為柑橘中手性類黃酮物質的開發利用提供理論參考。

圖1 柚皮素抗氧化作用原理

1 柚皮素的提取方法

柚皮素的提取對分析結果至關重要，某種程度上來說，前處理決定了分析測試的結果，直接影響分析數據的精確性。柑橘中柚皮素等類黃酮成分檢測的前處理提取方法常用的為溶劑萃取法[12]，利用該組分在兩種互不相溶的試劑中分配系數的不同，使其從一種溶液轉移至另一種溶劑，從而達到分離和富集的目的，但萃取溶劑通常易揮發、易燃、用量大，且有毒性；其他方法還有酶解法、超聲波提取法等。

1.1 單一提取法

國內外研究人員對植物中類黃酮等有效成分的提取方法做了較多的研究。Wu[13]等用深共熔溶劑（Deep-eutectic Solvent，DES）輔助超聲萃取（Ultrasound-assisted extraction，UAE）辣木的總酚和類黃酮含量，提供了一種綠色高效的方法；Molina[14]等用沖擊波輔助提取太子參藥材中酚酸和類黃酮，與常規溶劑法比，提取效率明顯更高；Mai[15]等通過超聲輔助萃取和溫度誘導濁點提取（Temperatureinduced cloud point extraction，TICPE），開發了一種從大葉黃楊中同時提取和富集類黃酮化合物的綠色方法，具有更高的萃取效率和更好的萃取選擇性；Yu[16]等用超聲波輔助提取積雪草中類黃酮，顯著提高了提取率；Song[17]等用超臨界二氧化碳流體萃取新疆棗葉中黃酮類化合物，可得到更高的總類黃酮含量及更強的抗氧化和抗增殖活性。

1.2 酶解提取法

更完全地提取有效成分，必須去掉由果膠質、纖維素和半纖維素及木質素等構成的細胞壁，而采用生物酶解法是專一高效的催化方法。酶不僅用于細胞壁降解，還有利于增加目標化合物的溶解度，增加提取效率。常用的酶如果膠酶（Polygalacturonase）是一組復雜的酶，可降解植物組織中存在的各種果膠類物質[18]，在水果、造紙和紡織工業中具有潛在的應用。Chen等用酶解輔助提取銀杏葉中黃酮類化合物，改善了提取效果，提高了提取率[19]；細胞壁降解酶能改善從小球藻中提取脂質的能力[20]；堿預處理再輔助酶處理，能破壞細胞壁并從擬微球藻中提取脂質[21]；纖維素酶增加了稻草糖化過程中酚酸的釋放[22]；Wilkins等用纖維素酶和果膠酶水解葡萄柚果皮廢料，產生糖，將其用于生產乙醇[23]；Wei等用雙酶輔助鹽漬法提取草種子中的黃酮，可用于大量生產類黃酮[24]。

1.3 超聲波提取法

超聲波獨具的物理特性能促使植物細胞組織破壁或變形，使有效成分提取更充分，可直接用于提取目標化合物，是一種比較常見的類黃酮提取方法。Qiao等利用超聲波聲化學作用處理了柑橘中14種類黃酮[25]；Yang[26]等使用結合熱回流萃取（Heat Reflux Extraction，HRE）和超聲輔助的聯用方法（Heat and Ultrasonics-assisted Extraction，HUAE）從半枝蓮中提取類黃酮，明確了該方法的優越性。Meng[27]等用超聲輔助深共熔溶劑提取黃酮，除了減少了對環境的影響，更提高了提取效率；Belwal[28]等用超聲波輔助大規模提取梨果皮中花色苷，用于大批量提取和工業應用。

1.4 超聲波輔助酶解提取法

超聲波也是酶催化反應的強大工具，可以影響酶和底物的結合，進而改善果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶活性[29]。超聲通過瞬時空化在介質中產生的強對流而增加了酶促過程中的碰撞次數，并通過增加酶與有機分子之間的相互作用來提高降解效率[30]，因此采用超聲波輔助酶解可以有效提高反應效率。低頻超聲的振幅，反射器的存在，與角的距離和基板的形狀均可影響纖維素酶水解的效率[31]。通過超聲可增強甘蔗渣的酶解作用，還原糖釋放的增加[32]；Subhedar[33]等利用超聲波輻照輔助酶促水解生產可發酵糖，進一步生產生物乙醇；Lei[34]等酶解-超聲輔助（EUAE）提取甜茶樹中的黃酮類化合物；張[35]等采用超聲波輔助酶法提取桑葚酒殘留物中花色苷，提高了生產效率；Subhedar[36]等利用超聲波強化廢報紙的酶促水解以生產可發酵的糖，將木質纖維素有效轉化為可發酵糖進而生產生物乙醇，超聲和酶的組合具有協同作用，可降低對酶和底物結合的擴散限制，并提高反應速率。

2 手性柚皮素的拆分方法

2.1 外消旋柚皮素的分析方法

關于類黃酮功能性成分的外消旋檢測前人已經做了較多的研究，較新的檢測方法包括：HPLC-DAD[37]、UHPLC-QqQ-MS/MS[38]、UPLC-QTOF-MS[39]等。外消旋柚皮素的檢測方法也有一些研究：UHPLC-QqQ-MS/MS[12]、傅里葉變換紅外光譜和高效液相色譜-紫外檢測-電噴霧電離串聯質譜[25]、LC-MS/MS[40]、SM-USA-MSPD-高效液相色譜法聯用[41]，均能滿足實驗需要。

2.2 手性旋柚皮素的拆分方法

目前，對于柚皮素功能方面的研究，均以外消旋體進行。事實上，柚皮素為手性化合物，有兩個對映異構體（圖2），手性對映體有相同的分子量、熔點、溶解度等，但也存在一些理化性質的差異。手性柚皮素與手性物質相互作用極有可能產生不同的產物，特別是許多與生物體密切相關的生化反應均和物質的手性相關聯。而目前尚未有手性柚皮素單體絕對構型的確認及手性單體的功能性研究。這是值得期待的研究領域，特別當一種對映體具有有益的生理活性，而另一種對映體對人體有害時，手性成分研究顯得尤為重要。1960年代的“反應停”致畸事件，就是手性化合物其中一個構型引起的慘劇。

圖2 手性柚皮素的兩個對映異構體

手性柚皮素的儀器拆分方法主要為液相色譜（High performance liquid chromato-graph，HPLC）和液相色譜質譜（High performance liquid chromatography-Mass，HPLC-MS）聯用，目前研究進展僅處于對映體的拆分，尚未確定柚皮素R-和S-的絕對構型，作為一個完整的檢測方法，均還有待完善。Gaggeri[42]等采用高效液相色譜分離了幾種果汁柚皮素，最終確認在手性柱Chiralpak AD-H用純甲醇（不含酸性或堿性添加劑）洗脫，分離度高，但該方法分離時間長，未做絕對構型和方法學確認。Si-Ahmed[43]等使用苯基氨基甲酸酯-丙基-β-環糊精手性固定相的納米液相色譜分離了柚皮素，該方法只保證了兩個單體的分離，同樣未做絕對構型和方法學確認；Wang[44]等開發的高速逆流色譜（Highspeed Countercurrent Chromatography，HSCCC）結合銅(II)-手性離子液體配合物和羥丙基-環糊精，重點做了兩個單體的分離，絕對構型和方法學均未做確認，且分離時間長，流動相復雜；Baranowska[45,46]等同時發表了兩篇關于柚皮素手性分離的研究，內容比較相似，采用RP-UHPLC-DAD的方法，拆分了對映體單體。

質譜是一種測量離子質荷比（質量-電荷比）的分析方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發生電離，生成不同荷質比的帶電荷的離子，經加速電場的作用，形成離子束，進入質量分析器。在質量分析器中，再利用電場和磁場使發生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質譜圖，從而確定其質量。也就是說，質譜是沒辦法確認立體結構，只能確定質量，因此，建立完善的手性柚皮素拆分方法具有非常大的必要性和緊迫性。

3 小結

目前，對柑橘類黃酮物質的研究還集中在外消旋混合物的分析和功能驗證，對手性類黃酮對映體的單獨或差異性研究仍鮮有報道。因此，建議在今后開展以下幾個方面的研究：一是在以柑橘類果皮、果肉和全果等為材料的手性柚皮素研究過程中，應采用綠色、高效的復合酶和超聲波協同技術，綜合考慮溫度、pH等對柚皮素溶解度和穩定性的影響[47]，優化最佳的前處理條件，降低目標功能性成分的損失，為精準鑒定評價手性柚皮素。二是開展手性柚皮素單體的功能性驗證。通過對柑橘柚皮素進行手性單體制備，開展抗氧化能力差異性評價。三是通過分子生物學技術，開展柑橘類手性柚皮素的基因調控、代謝組學等機理研究，為提高柑橘優質資源開發利用提供理論參考。