蠐螬多糖的熒光標(biāo)記研究*

張宇潔，杜 研，張欣蕾

（西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021）

蠐螬，是金龜子的幼蟲(chóng)，具有破血、行瘀、通乳等多種藥理作用, 主治淤痛、痛風(fēng)、破傷風(fēng)和喉痹等。蠐螬多糖是其主要活性成分，與植物多糖相比，動(dòng)物多糖的活性更加突出。現(xiàn)有研究表明, 蠐螬多糖對(duì)抑制腫瘤生長(zhǎng)有重要的作用[1]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于蠐螬多糖的研究主要在于提純分離和其抗腫瘤的生物學(xué)活性方面[2]。多糖類(lèi)由于其分子量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，缺乏發(fā)色基團(tuán)和熒光基團(tuán)，使其難以檢測(cè)，給其生物機(jī)制及藥代動(dòng)力學(xué)的相關(guān)研究帶來(lái)極大困難，無(wú)法確切知道其是如何發(fā)揮作用的。

本文利用多糖的還原末端與熒光物質(zhì)8-氨基-1,3,6 奈三磺酸二鈉鹽（ANTS）進(jìn)行反應(yīng)，對(duì)蠐螬多糖進(jìn)行熒光標(biāo)記，對(duì)標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，然后通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察合成過(guò)程中的某些參數(shù)是否對(duì)其有影響，并測(cè)定了熒光取代度，實(shí)現(xiàn)了熒光檢測(cè)器檢測(cè)或追蹤多糖，為多糖的生物機(jī)制研究及藥代動(dòng)力學(xué)的研究提供一定思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

BS-100A 自動(dòng)部分收集器、HL-1B 數(shù)顯恒流泵（上海滬西分析儀器廠）；熒光分光光度F-4600（株式會(huì)社日立制作所）；Multiskan GO 酶標(biāo)儀1510（Thermo Fisher Scientific）；Agilent cary100 型雙波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、HPLC Agilent 1260InfinityⅡ型、熒光檢測(cè)器G7121A（Agilent 公司）。

8-氨基-1,3,6 奈三磺酸二鈉鹽（98%）、氰基硼氫化鈉（95%）（Aladdin）；Sephadex G-25（生物技術(shù)級(jí)）（GE healthcare）；蠐螬均一多糖（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ANTS 標(biāo)記蠐螬多糖的方法 精密稱(chēng)定蠐螬多糖約10mg，溶于1mL 新鮮配制的0.2mol·L-18-氨基-1，3，6 奈三磺酸二鈉鹽（ANTS）的醋酸水溶液中（pH 值為5.5）。再向體系中加入1mL 新鮮配制的1.0mol·L-1NaBH3CN 的二甲基亞砜（DMSO）溶液，于40℃恒溫水浴下密閉，避光反應(yīng)20h。

將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)入洗凈的截留分子量為1000 的透析袋中加水透析24h，收集透析液濃縮至1mL，經(jīng)Sephadex G-25 分離純化，以蒸餾水為洗脫溶劑，每3mL 洗脫液收集一管。測(cè)定各管洗脫液在360nm 下的吸光度（ANTS 的吸收），多糖-苯酚-濃H2SO4（1∶1∶8） 反應(yīng)后測(cè)得各管洗脫液在490nm 下的吸光度（多糖的吸收），收集在兩個(gè)波長(zhǎng)處都有吸收的共有峰洗脫液，濃縮后凍干即得黃色疏松狀固體粉末蠐螬多糖-ANTS。

1.2.2 蠐螬多糖標(biāo)記重要參數(shù)的單因素考察 熒光標(biāo)記蠐螬多糖方法中，我們通過(guò)考察蠐螬多糖與ANTS 反應(yīng)的時(shí)間（16、20、24、30h），溫度（80、60、40、25℃），反應(yīng)時(shí)介質(zhì)的pH 值（4.5、5.5、6.5、7.5），ANTS 濃度（0.05、0.1、0.2、0.3mol·L-1），3 個(gè)條件不變，只改變一個(gè)條件，確定這些因素是否影響熒光物質(zhì)標(biāo)記蠐螬多糖的效率。

2 結(jié)果與討論

2.1 蠐螬多糖-ANTS 熒光標(biāo)記物的鑒定結(jié)果

2.1.1 熒光標(biāo)記物可見(jiàn)-紫外光譜掃描 用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)多糖進(jìn)行光譜掃描，掃描波長(zhǎng)為200～700nm，蠐螬多糖-ANTS 在360nm 處出現(xiàn)了特征吸收峰，而蠐螬多糖本身在此區(qū)間無(wú)吸收，可推斷蠐螬多糖已經(jīng)與ANTS 發(fā)生了反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 經(jīng)熒光標(biāo)記的蠐螬多糖紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet spectrum of fluorescently labeled polysaccharide

2.1.2 熒光標(biāo)記物的熒光光譜掃描 在激發(fā)波長(zhǎng)200～450nm、發(fā)射波長(zhǎng)400～650nm 范圍內(nèi)對(duì)蠐螬多糖-ANTS 進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，蠐螬多糖-ANTS 最大激發(fā)波長(zhǎng)在360nm 處，最大發(fā)射波長(zhǎng)在520nm處，可推斷ANTS 已經(jīng)與蠐螬多糖發(fā)生了反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 熒光標(biāo)記物熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectrum of fluorescent markers

2.1.3 熒光標(biāo)記物的高效液相色譜測(cè)定

2.1.3.1 色譜條件

色譜柱 TSK-GEL G4000PWXL（7.8mm×30.0cm，TOSOH）

流動(dòng)相 0.05mol·L-1Na2SO4水溶液（水為去離子水）

流速 0.4mL·min-1

柱溫 25℃

進(jìn)樣量 10μL

檢測(cè)器 熒光檢測(cè)器

2.1.3.2 樣品檢測(cè) 分別精密稱(chēng)取蠐螬多糖、ANTS、蠐螬多糖-ANTS 適量，用蒸餾水配成濃度為0.1mg·mL-1的溶液，用高速離心機(jī)以12000r·min-1的速率離心15min，取上清液加入樣品管中，取10μL 進(jìn)樣，激發(fā)波長(zhǎng)為360nm、發(fā)射波長(zhǎng)為520nm 下使用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 高效液相色譜圖Fig.3 HPLC of Polysaccharide

由圖3 可知，蠐螬多糖本身檢測(cè)不到，經(jīng)ANTS標(biāo)記后的蠐螬多糖能被檢測(cè)到，且保留時(shí)間較ANTS 縮短，因?yàn)闃?biāo)記后的蠐螬多糖分子量變大，所以保留時(shí)間縮短，但熒光檢測(cè)器依然能檢測(cè)到，由此可得，熒光物質(zhì)已經(jīng)成功標(biāo)記到了多糖上。

2.2 蠐螬多糖標(biāo)記方法的單因素考察[3]

2.2.1 蠐螬多糖與ANTS 的反應(yīng)時(shí)間考察

由圖4A 可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蠐螬多糖與ANTS 反應(yīng)形成的化合物在360nm 的吸收值逐漸增加，但20h 后趨于平緩，因此，確定反應(yīng)時(shí)間為20h。

2.2.2 蠐螬多糖與ANTS 反應(yīng)的溫度考察

由圖4B 可知，隨著溫度升高，在40℃時(shí)，形成的蠐螬多糖-ANTS 合成物在360nm 下吸收值最大，以后逐漸減小。因此，確定反應(yīng)溫度為40℃。

2.2.3 蠐螬多糖與ANTS 反應(yīng)pH 值考察

由圖4C 可知，蠐螬多糖-ANTS 合成物在360nm 下的吸收值在pH 值為5.5 的時(shí)候最佳。

2.2.4 蠐螬多糖與ANTS 反應(yīng)的ANTS 濃度考察

由圖4D 可知，ANTS 濃度影響反應(yīng)過(guò)程并不是很明顯，為節(jié)約成本，加入不影響反應(yīng)的ANTS 的量。

圖4 單因素考察結(jié)果Fig.4 Single-factor result

2.3 熒光標(biāo)記物的熒光取代度測(cè)定

精密稱(chēng)取ANTS 適量，用蒸餾水配成濃度為58μg·mL-1的溶液。分別量取1.0、2.5、5.0、7.5 和10mL 母液于干燥的50mL 容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度線處，稀釋得到濃度為1.16、2.9、5.8、8.7 和11.6μg·mL-1的溶液。用石英比色皿測(cè)定各溶液在360nm 下的吸光度值。以ANTS 溶液濃度作橫坐標(biāo)，以各濃度吸光度值為縱坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0246x-0.001，相關(guān)系數(shù)r=0.9992，結(jié)果表明，ANTS在1.16～11.6μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密稱(chēng)定蠐螬多糖-ANTS 適量，配成濃度為38μg·mL-1的溶液，測(cè)定該溶液在360nm 下的吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到標(biāo)記物中ANTS 的含量，以ANTS 的含量計(jì)算蠐螬多糖熒光標(biāo)記物中ANTS 的取代度為1.56%。

3 結(jié)論

在國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道中，許多采用放射性同位素標(biāo)記多糖研究其生物活性和分子機(jī)制，但由于放射性物質(zhì)會(huì)對(duì)人身體造成危害而不便應(yīng)用。因而采用化學(xué)合成法，通過(guò)多糖上的特征結(jié)構(gòu)，將熒光物質(zhì)結(jié)合到多糖上的熒光標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為目前應(yīng)用非常廣泛的一項(xiàng)技術(shù)。已知有多種熒光物質(zhì)可以通過(guò)多糖特征性還原末端同其發(fā)生反應(yīng)，如異硫氰酸熒光素（FITC）、2-氨基吡啶（AP）、8-氨基-1，3，6 奈三磺酸二鈉鹽（ANTS）、6-氨基喹啉（AQ）、4-氨基芐腈（ABN）、2-氨基吖啶酮[4]等。

本文實(shí)驗(yàn)利用8-氨基-1,3,6 萘三磺酸二鈉鹽（ANTS） 的氨基首先與蠐螬多糖還原端醛基發(fā)生親核反應(yīng)，消去一分子水，形成席夫堿，席夫堿不穩(wěn)定，還原劑NaBH3CN 迅速將其還原成穩(wěn)定的二級(jí)胺，達(dá)到熒光標(biāo)記的目的[5]。再通過(guò)透析、凝膠色譜等方法進(jìn)行分離純化，得到較純的多糖熒光標(biāo)記物。因?yàn)槎嗵窃?60 和490nm 下沒(méi)有特征吸收，而ANTS 在360nm 下有特征吸收，多糖-苯酚-濃H2SO4（1∶1∶8） 顯色反應(yīng)后多糖在490nm 下有特征吸收，從而根據(jù)紫外圖譜判別ANTS 是否連接到多糖上。ANTS 的最大激發(fā)波長(zhǎng)在360nm 處，最大發(fā)射波長(zhǎng)在520nm 處，從而根據(jù)熒光圖譜判別ANTS 是否連接到多糖上。多糖本身無(wú)熒光，所以在熒光檢測(cè)器的高效液相色譜圖上無(wú)色譜峰，ANTS 在相同色譜條件下色譜峰的保留時(shí)間在13min，而經(jīng)ANTS 標(biāo)記后的蠐螬多糖色譜峰保留時(shí)間在10min。這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)標(biāo)記后的蠐螬多糖分子量變大，在凝膠色譜柱上保留時(shí)間縮短，由此可得ANTS 已經(jīng)成功標(biāo)記到了當(dāng)歸多糖上。

在考察蠐螬多糖與ANTS 反應(yīng)的單因素實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，最佳條件是pH 值為5.5，40℃條件下反應(yīng)20h時(shí)反應(yīng)率最高。