基于UPLC 指紋圖譜及多指標定量分析的訶子藥材質(zhì)量研究*

王 巍，張 強，陳九妹，鞠成國

（遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600）

訶子原產(chǎn)于印度、緬甸等地，原名“訶黎勒”，在唐代隨佛教傳入我國，目前，收載于《中國藥典》2020版一部，為使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz.及絨毛訶子Terminalia chebula Retz. var. tomentella Kurt. 的干燥成熟果實[1]，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽之功效，多用于治療“腸澼”。本課題組在研究過程中收集到的藥材多為訶子，極少見絨毛訶子。其中部分云南和新疆所產(chǎn)訶子藥材與廣西、廣東所產(chǎn)訶子藥材在外觀上存在較大差別。藥典中對訶子的質(zhì)量控制方法還僅限于顯微鑒別和以對照藥材為參照的薄層色譜鑒別，欠缺對主要成分的定性及定量分析。鑒于此情況，本研究在建立訶子高效液相指紋圖譜的基礎(chǔ)上，對共有峰進行主成分分析，并對可識別的主要成分進行含量測定，為訶子藥材的質(zhì)量評價提供依據(jù)，并為對其進行深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與藥材

1260 Infinity II 型超高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；FA1004B 電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。

沒食子酸、鞣花酸購自成都曼思特生物科技有限公司（純度≥98%，批號分別為MUST-13040103、MUST-14031010），柯里拉京、訶黎勒酸、五沒食子酰基葡萄糖、訶子酸購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司（純度≥98%，批號分別為PRF9101742、PRF8112 302、PRF9091704、PRF8071201）；沒食子酸乙酯為本實驗室自制，經(jīng)HPLC 鑒定純度≥98%；甲醇、H3PO4為色譜純；水為超純水。17 批訶子藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學張慧教授鑒定均為訶子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果實。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液制備 精密稱取各批次訶子粉末（去核，粉碎，過60 目篩）0.1g，加入70%甲醇溶液50mL，精密稱定重量，超聲提取20min，放冷，再以70%甲醇溶液補足損失重量，搖勻，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得[2]。

1.2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取沒食子酸、沒食子酸乙酯、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖、訶子酸對照品適量，置于10mL 容量瓶，加入甲醇定容，分別制成濃度為0.22250、0.17400、0.68875、0.25250、0.17750、0.31625、0.49125mg·mL-1的對照品溶液。

1.2.3 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（100mm×3.0mm，2.7μm）；流動相0.3%磷酸水（A）：甲醇（B），梯度洗脫，程序如下：0～3min，B 為3%；3～5min，B 為3%～5%；5～15min，B 為5%～8%；15～25min，B 為8%～14%；25～30min，B 為14%～18%；30～35min，B 為18%～20%；35～38min，B 為20%～25%；38 ～45min，B 為25%；45 ～55min，B 為25% ～30%；55 ～60min，B 為30% ～45%；60 ～65min，B 為45% ～60%；65 ～70min，B 為60% ～100%；70 ～78min，B 為100%；78～80min，B 為100%～3%；。進樣量2μL，流速0.8mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長270nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 指紋圖譜方法學考察

2.1.1 精密度試驗 取S1批次樣品，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.3”項條件下連續(xù)進樣6 次，以訶黎勒酸計算各對照品相對保留時間RSD分別為0.82%、0.80%、0.67%、0.00%、0.95%、0.66%、0.78%，相對峰面積RSD 分別為1.30%、1.12%、1.35%、0.00%、1.19%、1.36%、1.22%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性試驗 取S1批次樣品，按“1.2.1”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“1.2.3”項條件下進樣，以訶黎勒酸計算各對照品相對保留時間RSD分別為0.69%、0.68%、0.71%、0.79%、0.69%、0.68%、0.68%，相對峰面積RSD 分別為1.80%、1.92%、1.67%、1.77%、1.68%、1.82%、1.71%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗 取S1批次樣品，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.3”項條件下，分別于制備后0、2、4、8、12、18、24、36、48h 進樣，以訶黎勒酸計算各對照品相對保留時間RSD 分別為0.91%、0.87%、0.96%、0.00%、0.79%、0.90%、0.89%，相對峰面積RSD 分別為1.91%、1.87%、1.97%、0.00%、1.82%、1.80%、1.88%，表明供試品溶液在48h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 指紋圖譜建立

取各批次訶子（共17 批），按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.3”項下色譜條件進樣檢測，將所得色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”，去除溶劑峰，剪切65min 之前的色譜峰，進行共有峰的匹配，中位數(shù)法生成對照圖譜，以對照圖譜計算各批次的相似度[3]。結(jié)果共識別26 個共有峰，與對照品對比鑒定，其中2 號為沒食子酸，11 號為沒食子酸乙酯，12 號為柯里拉京，19 號為訶黎勒酸，21 號為鞣花酸，22 號為五沒食子酰基葡萄糖，23 號為訶子酸。各批次相似度在0.626～0.971 之間，其中S8為0.626、S5為0.895、S10為0.841、S16為0.856，其余均在0.9 以上。各批次訶子指紋圖譜疊圖見圖1。

圖1 各批樣品UPLC 指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprints of different batche samples

2.3 主成分分析

將17 批樣品共有峰的峰面積作為原始數(shù)據(jù)，以SPSS 17.0 軟件進行主成分分析，將數(shù)據(jù)標準化處理后計算相關(guān)矩陣的特征值及方差貢獻率，結(jié)果見表1。

表1 UPLC 指紋圖譜的主成分信息和方差貢獻率Tab.1 Principal component information and variance contribution rate of UPLC fingerprint

由表1 可見，以特征值（VIP）＞1 為提取標準[4]，得到前7 個主成分的累計方差貢獻率為91.182%（＞80%），說明前7 個主成分反映了訶子26 個成分中91.182%的信息量，基本上可以代表訶子UPLC指紋圖譜的特征。

對各主成分的權(quán)重比例與各共有峰對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 主要因子載荷矩陣表Tab.2 Main factor load matrix table

由表2 可見，7 種已知成分和其他未知成分均作為主要信息參與了訶子的質(zhì)量表達，其中第1 主成分主要反映了色譜峰6、8、9、10、16、17、19 （訶黎勒酸）、20、22（五沒食子酰基葡萄糖）的信息，第2 主成分主要反映了色譜峰2（沒食子酸）、11（沒食子酸乙酯）、12（柯里拉京）、15、23（訶子酸）、24 的信息，第3 主成分主要反映了色譜峰26 的信息，第4 主成分主要反映了色譜峰3 的信息，第5 主成分主要反映了色譜峰25 的信息，第6 主成分主要反映了色譜峰14 的信息，第7 主成分主要反映了色譜峰21（鞣花酸）的信息。

2.4 含量測定方法學考察

本研究建立的指紋圖譜分析方法，可同時對訶子中沒食子酸、沒食子酸乙酯、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖、訶子酸7 種主要成分進行含量測定。方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗參見“1.2.1”項下部分。

2.4.1 專屬性試驗 取S1批次樣品，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，取沒食子酸、沒食子酸乙酯、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖、訶子酸苷對照品，按“1.2.2”項下方法制備對照品溶液，并制備混合對照品溶液，分別在“1.2.3”項下條件進樣。對照品溶液與供試品溶液色譜圖中各對照品色譜峰與相鄰峰分離良好。結(jié)果見圖2。

圖2 各成分UPLC 色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密稱取沒食子酸、沒食子酸乙酯、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖、訶子酸對照品，以甲醇溶解并逐級稀釋。分別在“1.2.3”項條件下進樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，回歸方程分別為：沒食子酸y=8672.1x+4.0441（r=0.9999）；沒食子酸乙酯y=5746.9x+0.9143（r=0.9999）；柯里拉京y=4699.9x-11.578（r=0.9999）；訶黎勒酸y=3790.5x-1.0095 （r=0.9998）； 鞣花酸y =6414.9x -1.445（r =0.9999）；五沒食子酰基葡萄糖y=5999x+0.8232（r=0.9999）；訶子酸y=3979.1x-2.6536（r=0.9999）。結(jié)果表明：沒食子酸在4.45～222.5μg·mL-1，沒食子酸乙酯在3.48～174μg·mL-1，柯里拉京在13.78～688.75μg·mL-1，訶黎勒酸在5.05～252.5μg·mL-1，鞣花酸在3.55～177.5μg·mL-1，五沒食子酰基葡萄糖在6.33 ～316.25μg·mL-1，訶子酸在9.83～491.25μg·mL-1與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4.3 加樣回收率試驗 分別精密稱取6 份已知含量S1批次樣品0.1g，加入相當于樣品中成分含量100%的7 種對照品，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.3”項條件下進樣，計算加樣回收率及RSD，結(jié)果表明，沒食子酸加樣回收率為98.96%，RSD為1.60%；沒食子酸乙酯加樣回收率為99.00%，RSD為1.68%；柯里拉京加樣回收率為99.03%，RSD 為0.95%；訶黎勒酸加樣回收率為99.79%，RSD 為1.05%；鞣花酸加樣回收率為98.41%，RSD 為1.19%；五沒食子酰基葡萄糖加樣回收率為100.39%，RSD 為1.22%；訶子酸加樣回收率為100.22%，RSD 為0.94%，均符合要求。

2.5 樣品含量測定

取17 批樣品，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.3”項下條件進行分析，根據(jù)外標一點法分別計算各成分含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of various constituents

2.6 討論

訶子在我國藏醫(yī)、蒙醫(yī)中應(yīng)用極其廣泛，地位相當于中醫(yī)中的甘草。據(jù)文獻報道，藏醫(yī)、蒙醫(yī)中超半數(shù)以上的復(fù)方含有訶子[4]。現(xiàn)代化學研究表明，鞣質(zhì)是訶子的主要化學成分[5-7]，其中沒食子酸、沒食子酸乙酯、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸和訶子酸是含量較高的幾種鞣質(zhì)，而五沒食子酰基葡萄糖為一分子葡萄糖的1、2、3、4、6 位連接五分子沒食子酸，這7 種化合物是訶子中的代表性化合物，也是訶子的潛在質(zhì)量標志物。然而現(xiàn)行中國藥典中并未對訶子中主要成分含量有所規(guī)定，在很大程度上限制了訶子質(zhì)量評價系統(tǒng)的完善。本實驗的指紋圖譜相似度結(jié)果表明，各批次訶子相似度差別較大，質(zhì)量不一，其中S8質(zhì)量較差，相似度最低，從圖譜中可以明顯看出與其它批次具有顯著差異。主成分分析結(jié)果顯示，7 個指標成分均作為主要信息因子參與了訶子的質(zhì)量表達，表明7 個指標成分的含量與藥材質(zhì)量高度相關(guān)，可直接影響藥材質(zhì)量。7 個指標成分的含量測定結(jié)果表明，各個批次成分含量差別較大，說明訶子各批次存在差異，驗證了相似度的結(jié)果。

3 結(jié)論

本實驗方法以指紋圖譜相似度、主成分分析以及含量測定結(jié)果綜合評價訶子藥材質(zhì)量，結(jié)果準確，可為訶子臨床用藥的安全有效提供依據(jù)及保障。本實驗識別的7 種指標成分可反映訶子藥材質(zhì)量，可能為訶子的潛在質(zhì)量標志物。本實驗在藥材收集時并未收集到絨毛訶子，后續(xù)對于訶子藥材的質(zhì)量評價還需更全面的深入研究。