山黧豆分子標記的開發及遺傳多樣性研究進展

嚴 昕 李孟偉 劉 榮 李 冠 王 棟季一山 王晨瑜 黃淑賢,2 宗緒曉 楊 濤

（1.中國農業科學院作物科學研究所 北京100081；2.黑龍江八一農墾大學生命科學與技術學院 大慶163319）

山黧豆（Lathyrus sativus L.），又名草香豌豆，是豆科蝶形花亞科山黧豆屬下一個多用途的冷季豆栽培種。 由于其根系堅韌而有穿透力，可在干旱和洪水多發的環境和貧瘠的土壤中生長[1-2]。 除作為人類食品和動物飼料、綠肥作物外，山黧豆與根瘤菌共生，能使土壤中的氮素得到有效固定， 提高土壤肥力、降低作物輪作所需的投入， 使其成為輪作體系中的重要作物[3]。 由于山黧豆種子和植株中含有β-ODAP（β-N-草酰基-L-α,β-二氨基丙酸）， 作為谷氨酸類似物，在神經系統中與谷氨酸受體結合，可使神經元細胞受損或凋亡[4]。 長期大量食用山黧豆會引發特征性運動系統疾病[5]，具有食物中毒的潛在風險，使得其推廣和利用受到限制。 分子標記作為輔助育種的工具，應用于遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構建、重要基因的定位起源與進化關系的闡述等。 由于山黧豆的發展較其他作物落后，關于山黧豆DNA 水平的研究較少， 因此筆者對近幾十年來關于山黧豆屬分子標記的開發及遺傳多樣性等研究進展進行概述，并針對其未來的研究方向提出建議。

1 山黧豆種質資源研究概況

1.1 山黧豆的起源與分布

山黧豆的遺跡最早于公元前3 000 多年前在印度和西亞發現[6]。 有關山黧豆的實際起源不詳，目前，一般認為山黧豆起源于南歐和西亞， 后來擴展到地中海地區[7]。 山黧豆的物種多樣性分布在歐洲、亞洲和北美洲，并延伸到南美洲和東非，但多樣性的主要中心仍然主要在地中海和伊朗—土耳其地區[8]，地中海地區的栽培山黧豆具有高產、粒大等特點，種質優異。 山黧豆屬分布范圍廣泛（表1），包括中東、中歐、東歐、南歐和南美部分地區，埃及和阿爾及利亞也有栽培，但規模比較小。 在中國的西北和華北地區，比如甘肅、山西、陜北、內蒙古等也有山黧豆的種植。

表1 山黧豆屬的分類與分布

1.2 山黧豆收集、保存

中國自建國以來， 開始收集和引進山黧豆種質資源，培育山黧豆品種，截至2018 年，國家種質庫共收集引進山黧豆屬種質資源476 份， 涉及地方資源和野生近緣種， 其中國內收集的地方資源有36 份。山黧豆因其具有經濟價值和生態價值， 各國展開不同程度的種質資源收集與保存工作， 一些重要的山黧豆屬種質資源已經收集起來， 并在世界各地的一些不同研究所異地保存。 法國國家植物保護機構（CBNPMP）（4 477 份） 和敘利亞國際植物保護機構（ICARDA）（3 239 份）保存了數量最多的山黧豆屬品種，約占 50%（表 2）。

表2 山黧豆屬主要種質資源的收集

1.3 種質資源研究利用

山黧豆為一年生草本植物， 可以在惡劣的環境條件下生存。 強大而穿透力強的根系使其能夠在多種土壤類型中生長， 包括非常貧瘠的土壤和黏土[11]，而其利用殘留水和土壤養分的能力使該物種適應了低投入或零投入。 此外， 它能與豆科根瘤菌有效結瘤，使土壤富含氮，可用于之后的農作物[12]。李屹峰等以金燕18 號燕麥為試驗作物，在晉西北進行了2 年的大田施氮試驗，結果表明，山黧豆田間留茬能提高土壤氮含量和燕麥籽粒產量[13]。況勝劍等提出山黧豆用于培肥土壤及提升景觀效應的最適種植密度應分別為 30 kg/hm2和 45 kg/hm2[14]。因此，在干旱地區，當農田不能施以有機肥時，山黧豆可留田作為綠肥間、套種植繼續給作物供給營養[15]。山黧豆在飼料喂養實踐中， 最早喂食的是莖葉部分， 其蛋白質含量達到18.82%～20.14%，粗蛋白含量與苜蓿含量相差很小[16]，在我國西北地區山黧豆可作為潛在的飼料資源。 與其他豆類相比，山黧豆對許多害蟲（包括貯藏昆蟲）的抵抗力也更好。 由于山黧豆耐旱、耐澇、耐瘠薄、產量穩定、品質性狀好，可以作為牧草、綠肥或飼食多功能作物，具有較高的社會經濟價值。

2 山黧豆分子標記開發研究進展

目前，DNA 分子標記技術發展迅猛，廣泛應用于分子標記輔助育種、 遺傳連鎖圖譜構建、QTL 定位、圖位克隆等方面[17]。 分子標記是DNA 水平遺傳多態性的直接反映，是對形態學表征的有效補充，因為它們是高效的， 不受植物組織或環境影響， 并且可以在作物或牧草發育的早期進行品種真實性鑒定[18]。迄今為止，一些分子標記如AFLPs（Amplified Fragment Length Polymorphisms， 擴 增 片 段 長 度 多 態 性 ）[19]、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性 DNA）[20]和 RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段長度多態性）[21]、ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，簡單序列間重復）[22]等已被成功地用于研究Lathyrus 屬內的遺傳變異或種間關系。RAPD 是通常為10 個堿基的標記，具有較廣的共通性，合成的一套引物能用于不同的物種。 RFLP 技術鑒定物種的多態性不受環境條件和發育階段的影響，在等位基因與非等位基因上能產生不同的效應，因而互不干擾。 SSR 標記是遺傳多樣性研究中常用的、信息量大的分子標記，到目前為止，利用SSR 標記對山黧豆屬遺傳多樣性的研究還很少。 近年來，在全基因組高通量測序技術的推動下， 分子標記開發數量呈指數級增加。 第 3 代 DNA 遺傳標記 SNP（Single Nucleotide Polymorphism， 單核苷酸多態性）標記具有密度高、遺傳穩定的特點，而且幾乎都以二等位多態性存在， 檢測時無需對片段的長度作出測量，極易實現自動化，可幫助區分2 個個體遺傳物質的差異， 除了SNP， 第3 代分子標記還包括 KASP、InDel 等。 開發和利用分子標記進行DNA 多態性的檢測和利用，是分子遺傳學領域最重要的發展之一。它們以其更準確、更方便、更快捷的方法彌補了田間形態學鑒定和生化標記鑒定方法的不足。

據資料統計，Lioi 等[23]搜索EMBL 核苷酸序列數據庫中可用的山黧豆屬DNA 序列，得到了20 對SSR引物， 利用在意大利收集的地方品種， 結合農藝性狀，篩選出6 對具有多態性的分子標記。 Sun 等[24]通過篩選美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫鑒定了300 對EST-SSR 引物， 并對來自世界各地的24 份山黧豆種質資源進行驗證，其中44 對EST-SSR標記具有多態性。 Shiferaw 等[25]利用來自相關物種標記的跨物種轉移能力開發了來自模型物種蒺藜苜蓿的 19 對 EST-SSR 和 NCBI 數據庫中的山黧豆屬EST 序列，并驗證了多態性標記，在各地區中，Gojam、Gonder、Shewa 和 Welo 地區的多樣性水平較高，其中Gonder 地區的不同等位基因數量較多， 成功用于探索埃塞俄比亞草豌豆種質的遺傳多樣性。 Yang 等[26]利用454 FLX 鈦熱測序技術設計了50 144 對非冗余引物對，并隨機選擇288 對引物對24 份山黧豆材料進行擴增反應，共篩選出74 對多態性引物。 Almeida等[27]評價了蒺藜苜蓿、豌豆、扁豆、和蠶豆的分子標記對山黧豆的轉移能力， 并對這些分子標記在山黧豆屬中定位和多樣性研究中的應用進行了試驗， 他們采用RNA-Seq 技術開發200 個EST-SSR 標記。在這些標志物中，40 個標記在 2 份材料間具有 25 個（62.5%）多態性。 Hao 等[28]利用 RNA 轉錄組測序設計了3 204 個EST-SSR 引物，隨機選擇了284 個 ESTSSR 引物進行驗證。 在這些經過驗證的單基因中，有87 種（30.6%）EST-SSR 引物在選自不同地理位置的43 種豌豆種質中產生了多態性擴增子。同時，篩選了146 406 個 SNP， 隨機選擇了 50 個 SNP 位點進行競爭性等位基因特異性PCR（KASP）驗證。 超過 80%（42）SNP 位點已成功轉化為 KASP 標記。 Soren 等[29]使用CD-HIT 軟件對從國家生物技術信息中心（NCBI） 數據庫中檢索到草豌豆轉錄組組合進行檢測，并篩選出152 對SSR 引物，其中60 個具有多態性，并將來自7 個國家的50 份山黧豆屬材料分為4 個亞群。

3 山黧豆遺傳多樣性研究進展

遺傳多樣性是物種長期進化的產物， 是適應環境變化的前提。 遺傳多樣性越高，其遺傳或者變異越大，對惡劣環境條件表現出的適應能力較強，物種發生基因突變或者染色體變異的植株生存下來的可能性較大，從而提高了物種內的多樣性和基因頻率，為育種提供了可能性和重要的資源。 此外，遺傳多樣性的研究也揭示了物種的起源和種內親緣關系， 研究種質資源的遺產多樣性， 能為分析其進化和未來的發展提供重要的資料[30]。

山黧豆是自花授粉作物， 通過前人對山黧豆雜交發現，該物種花色、花的形狀與組成、籽粒大小等性狀能穩定遺傳，比如，來自歐洲和北非的白色種子較大， 而來自亞洲和埃塞俄比亞的有色種子相對較小[31]。因此不同地理位置和不同起源的山黧豆品種在這些性狀上有明顯差異， 也能根據這些性狀將山黧豆進行分群分類。Jackson 和Yunus[32]利用花的顏色和籽粒大小等性狀采用主成分分析和聚類分析對49份山黧豆種質資源進行了形態學變異研究分析，并對14 種山黧豆屬植物進行了變異評價，山黧豆屬作物顯示出巨大的形態學變異， 特別是在植被特征如葉長方面，而花的特征則變化較少。 這一系列的變異無疑是地理分離及人類選擇的結果。

此外，通過DNA 分子標記或者結合形態分析對山黧豆屬進行遺傳多樣性分析。 Barik 等[20]利用RAPD標記評估了所選山黧豆基因型之間的遺傳變異性，對優良基因型進行了鑒定， 揭示了它們之間的親緣關系。 RAPD 標記擴增出來的DNA 多態性也可被整合到標記輔助選擇和育種計劃中，能對這種重要營養作物物種進行遺傳改良。 Wang 等[33]利用30 個SSR位點分析了非洲、歐洲、亞洲和伊卡達地區野生和馴化群體283 個個體的遺傳多樣性和群體結構。 基于模型的種群結構分析將種質資源劃分為3 個亞群：近緣種、亞洲種、歐洲和非洲種。AMOVA 分析結果表明，栽培種與其近緣種差異較大，但其地理來源分化程度較低。 這些結果為了解山黧豆屬及其近緣種的遺傳多樣性提供了分子基礎。 Gupta 等[34]利用 18 對EST-SSR 標記將一組來自孟加拉國的100 種豌豆種質與18 種野生山黧豆屬種質進行了表征遺傳多樣性，通過聚類分析分成4 個主要類群，且第一類群由20 個具有高β-ODAP 濃度的材料組成， 其中17 種是野生的。 Kumari 等[35]使用 20 個 SSR 標記對 32 個山黧豆栽培品種進行了分子遺傳多樣性研究，有11 個標記被證明是多態性的，可以檢測到總共 21 個等位基因，揭示了29%的遺傳多樣性，通過鄰接UPGMA聚類分析的樹枝圖，將基因型分為3 個主要聚類。

目前，由于農業集約化、過度放牧、永久牧場減少，山黧豆屬的遺傳多樣性經歷了嚴重的遺傳侵蝕。就地保護和異地保護對山黧豆屬種質資源評價、保護物種多樣性、 降低遺傳沖刷和種質資源利用有不同程度的作用。 另外，隨著環境不同程度的惡化，各部門急需展開山黧豆屬搜尋和保護工作， 有效地應對糧食安全和氣候變化對作物產量的影響。

4 結語

植物遺傳資源保護， 對于滿足當前和未來作物改良需要至關重要。 然而， 由于現有的資源很少，評估工作僅限于幾個分散的種質收集中， 再加上目前的分子和生物技術育種工具有限， 山黧豆屬育種進展緩慢。 因此， 對于未被充分利用卻很有前途的山黧豆， 需要更有效、 更快速的育種方法。 山黧豆是一種可以在惡劣天氣條件下生存的作物， 因此可以作為困難時期生存的備用食品。 山黧豆雖是一種很有益的作物，但很少有人關注[36]，至于DNA 水平的研究就更少， 因此需要對其種質資源進行全面收集和廣泛的鑒定評價。 未來山黧豆研究， 應考慮將工作重心放在高質量的基因功能開發， 配合基因編輯技術， 挖掘重要的功能基因和特有的遺傳變異， 發揮山黧豆屬在產量和應對惡劣環境等方面的巨大潛力。 關于山黧豆新品種培育，研究者致力于選育低含量β-ODAP 或無毒的山黧豆， 對山黧豆種子產量與其構成因素的關系及其他重要性狀的研究報道相對較少，應考慮對山黛豆種子進行綜合研究開發。 為了實現有效的保護并增加種質資源的利用， 需要對現有栽培資源的多樣性進行詳細描述。 山黧豆種質多樣性水平不同的信息， 將有助于拓寬育種親本的遺傳背景， 并有助于尋找現代育種中尚未開發的基因和等位基因。