利用分子輔助選擇聚合抗稻瘟病基因選育黑糯稻新品系

陳萍萍 游月華 江 巍 戴展峰 彭玉林 黃水明

（龍巖市農業科學研究所 福建龍巖364000）

稻瘟病具有多種生理小種， 是水稻生產的主要病害，病情嚴重時，會影響水稻的產量和品質，給糧食生產造成重大的損失，高發區可以造成50%以上減產[1]。 但稻瘟病生理小種變異快，一個單基因的抗病品種育成后，往往種植2～3 年后就容易喪失抗性[2-3]。品種抗病性之所以喪失， 關鍵在于品種或抗源過于單一化， 通過將幾個抗稻瘟病基因聚合于同一個水稻材料中， 可以有效地避免或減緩水稻抗稻瘟病抗性能力喪失。 劉士平等[4]發展了與Pi-1連鎖的SSR標記RM144, 并利用分子標記輔助選擇將Pi-1基因導入珍汕97B。吳金紅等[5]開發了與Pi-2緊密連鎖的SSR 標記AP22。 陳紅旗等[6]利用分子標記技術聚合Pi-1、Pi-2和Pi-33基因改良金23B 的稻瘟病抗性，獲得了高抗稻瘟病的保持系， 其對稻瘟病的抗病頻率為96.7%。 孫富等[7]利用分子標記輔助聚合稻瘟病抗性基因Pi-1和Pi-2改良紅色特種秈稻桂紅一號的稻瘟病抗性，獲得了具有高抗稻瘟病的改良材料。

本研究利用稻瘟病抗病基因Pi-1、Pi-2和Pi-b的緊密連鎖的標記對育種分離世代水稻材料進行分子輔助育種選擇，并結合田間農藝性狀、稻瘟病抗性鑒定，快速、準確選育出聚合Pi-1、Pi-2和Pi-b3 個抗稻瘟病基因的黑色糯稻新品系。 選育聚合多個抗稻瘟病基因的水稻品種，是避免或減緩品種抗性喪失的有效途徑，通過分子輔助選擇結合田間育種技術，選育新的抗稻瘟病品種，為水稻抗病遺傳育種提供新的供體親本資源。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

中組14 是中國水稻研究所選育的抗白葉枯病、稻瘟病、褐飛虱和白背飛虱，且米質達到國標1 級的常規秈稻品種， 攜帶稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2和Pi-b，具有持久高抗稻瘟病特性，種子由浙江省農科院作核所提供。 巖紫糯是由龍巖市農科所選育的種皮顏色黑、營養品質高、產量較高的紫黑糯品種，稻瘟病抗性差。 龍巖市農科所選育的由中組14 與巖紫糯雜交、回交選育的優質有色稻中間材料。

1.2 抗性基因連鎖標記

由表1 可知，與緊密連鎖稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2和Pi-b緊密連鎖的標記分別是RM144、AP22和Pibdom[4-5,8]。

表1 水稻稻瘟病抗性基因的連鎖標記及引物序列

1.3 雜交、回交與選擇方案

以巖紫糯為母本，中組14 為父本，雜交獲得F1，然后以巖紫糯為母本與F1回交獲得BC1F1。為加快改良進程，在此后的自交選育過程中，通過單株的表現和分子標記檢測結果， 在各自交世代中選擇同時攜帶Pi-1、Pi-2和Pi-b3 個抗性基因且農藝性狀優良的單株，最后獲得抗稻瘟病的株系（圖1）。

圖1 分子輔助選擇聚合3 個水稻稻瘟病抗性基因的育種程序

1.4 稻瘟病抗性鑒定

2018 年晚季田間稻瘟病自然誘發鑒定圃設在福建省上杭縣茶地國家稻瘟病鑒定中心圃進行。 所用的菌株為福建省高感的菌株。 每個品種播種1 條，3 個重復，每條播種100 粒，四周設誘發行，以廣陸矮4 號、明恢86 和本地糯稻龍黑糯2 號為誘發品種。不噴施農藥，施氮肥，施用量高于普通大田20%。 出苗后30 d 人工噴施菌液使其充分發病。 按國際水稻所0～9 級的分級標準調查苗瘟、 葉瘟和穗頸瘟發病情況，調查方法參照鄭軼等[9]的方法。

1.5 農藝性狀及植株色素沉積和分布規律

1.5.1 農藝性狀 考察農藝性狀。

1.5.2 植株色素沉積和分布規律 用數碼單反相機觀察拍攝水稻不同生長階段、 不同組織部位的色素沉積和分布規律， 記錄不同發育天數的穎果的形態和色澤變化。

2 結果與分析

2.1 分子標記篩選

利用與Pi-1、Pi-2和Pi-b緊密連鎖的 SSR 標記RM144、AP22 和 Pibdom 對中組 14 與巖紫糯進行多態性分析， 中組14 與巖紫糯之間具有明顯的多態性。 結果見圖 2。 另外，對分子標記 RM144、AP22 和Pibdom 用于對水稻植株抗病選擇的可靠性進行了分析， 選用單個特異鑒別菌株對F2群體接種，RM144、AP22 和 Pibdom 對基因Pi-1、Pi-2和Pi-b基因篩選準確率達 90%。 說明利用 M144、AP22 和 Pibdom 分別對Pi-1、Pi-2和Pi-b基因進行分子輔助選擇改良水稻品種抗病性是完全可行的。

圖2 部分水稻植株抗性基因連鎖標記在BC1F3 群體中的分離

2.2 利用分子標記選擇抗稻瘟病株系

利用與抗性基因緊密連鎖的標記對不同自交世代進行選擇，結果見表2。 在BC1F1中，雜合帶型（帶型 2）與感病帶型（帶型 1）的分離比例符合 1∶1。 在BC1F1的自交群體中，根據分子標記檢測結果、農藝性狀表現和種皮顏色分別選擇3 株種皮為黑色的單株進行繁殖獲得BC1F2株系種子。 繼續種植3 個BC1F2群體，對這些世代進行分子標記檢測，各個分離世代均出現3 種帶型， 即與供體親本相同的純合抗病帶型、 抗感雜合帶型和與受體親本相同的純合感病帶型， 分離比例符合 1∶2∶1。 通過對農藝性狀觀察， 篩選獲得5 個純合抗病帶型種皮為黑色的水稻株系。

表2 BC1F1 和BC1F2 群體的分子標記檢測分析結果

2.3 聚合后代的抗性表現和農藝性狀系統選育

2018 年晚季， 將獲得的5 個穩定株系分別種植BC1F4群體，編號16-1～16-5。用福建稻瘟病高致病菌種對不同株系進行稻瘟病的苗瘟、 葉瘟和穗頸瘟的接種鑒定。 結果表明，5 個株系對高致病菌株均具有抗病能力，其苗瘟和葉瘟均為0 級，株系16-2 穗頸瘟 0 級，株系 16-1、16-3、16-4、16-5 穗頸瘟 1 級，綜合抗性評價為高抗稻瘟病（表3）。

表3 16-1~16-5 株系的抗性鑒定

同時調查5 個株系的農藝性狀，其中株系16-1 和株系16-2 農藝性狀表現穩定一致，豐產性最好（表4）。2019 年將這2 個株系進行小區品比試驗， 其中株系16-2 綜合性狀表現優異，暫時定名為龍黑198。

表4 株系16-1~16-5 農藝性狀比較

2.4 龍黑198 的農藝性狀與色素沉積與分布特征

2.4.1 龍黑198 的農藝性狀 優質多抗稻瘟病新品系龍黑198 綜合性狀好，全生育期136 d，屬于黑色秈糯類型。株型適中，株高138～142 cm，抗倒性強；分蘗性好， 單株成穗 9～12 個， 屬于散穗型， 每穗粒數 175～200 粒， 結實率 85.7%， 千粒重 25 g， 高抗稻瘟病。

2.4.2 龍黑198 的色素沉積與分布規律 為了揭示龍黑198 黑色色素的積累特征，本研究觀察龍黑198在不同生長階段、不同組織部位的色素沉積與分布。在整個生長周期內， 龍黑198 的莖稈和葉片均為綠色；稻穗發育早期穎殼有紫色色素沉積，顏色由淺變深， 抽穗后穎殼顏色逐漸由紫色轉為綠色進行光合作用（圖 3A、B）；柱頭為白色，無色素沉積（圖 3C）。隨著穎果灌漿，穎果發育早期（花后1～7 d），穎殼呈綠色，隨著穎果灌漿成熟，穎殼色素的積累，顏色由綠變紅， 進而由紅變紫變黑； 成熟時穎殼顏色為黑色（圖3D、F）。 通過仔細觀察穎果果皮的色素沉積后，發現花色素在穎果果皮中的沉積具有時序性， 在花后5～7 d 有色稻穎果果皮尖端就開始出現色素沉積，然后延伸到穎果兩端及背部維管束處的果皮沉積色素，后向整個穎果的果皮擴展，最后才是穎果中部和腹部沉積色素（圖3E），一般在花后10～15 d 內整個穎果的果皮充滿色素，隨著色素的沉積，顏色由紅變紫變黑，逐漸加深。

圖3 龍黑198 色素沉積與分布規律

3 討論與結論

Pi-b是第一個被圖位克隆的抗稻瘟病基因。Pi-1與Pi-2是2 個顯性廣譜稻瘟病抗性基因， 具有有良好的互補效應[6,10-11]。 通過接種75 個來自不同地域的稻瘟病菌株， 結果表明，Pi-1和Pi-2的抗譜分別高達 82.67%和 85.53%[12]。Pi-1對南、北方稻區 322 個單孢菌株表現為中等毒力，毒力頻率為22.36%，Pi-2表現為弱毒力，毒力頻率為6.83%[13]。 攜帶Pi-2的水稻品系IRBLz5-CA 對來自廣東的146 個稻瘟病菌株的抗性頻率為48.6%，攜帶Pi-1的水稻品系IRBL1-CL抗性頻率為80.1%，二者對不同生理小種的抗性具有很好的互補效應[14]。

本研究將Pi-1、Pi-2和Pi-b基因聚合到感病的紫黑色糯稻巖紫糯中，人工接種鑒定結果表明，聚合了3 個抗稻瘟基因的水稻株系能夠抗福建省內高致病菌株的侵染，自然病圃苗瘟和葉瘟均為0 級，穗頸瘟0～1 級，綜合評價達高抗稻瘟病水平。 研究表明，多個抗稻瘟病基因聚合后， 其抗性抗譜并不是單個抗稻瘟病基因之間的簡單累加， 而是通過基因間的互作效應，增強單個抗稻瘟病基因抗性能力，在聚合2～3 個抗稻瘟病基因后，水稻品種的抗性抗譜能夠增強拓寬。 多個抗性基因聚合是培育具有持久抗性水稻品種的有效方法，柳武革等[10]聚合Pi-1和Pi-2基因改良GD-7S 兩系不育系的稻瘟病抗性， 獲得5 個帶Pi-1和Pi-2基因的純合株系，其稻瘟病抗性較原始GD-7S 有大幅度提高。王軍等[15]聚合Pi-ta和Pi-b抗稻瘟病基因，選育出多抗高產的優質水稻新品系。本研究通過將Pi-1、Pi-2和Pi-b3 個抗稻瘟病基因聚合到優質、感稻瘟病的紫黑糯，獲得5 個高抗稻瘟病的株系，結合農藝性狀篩選出抗稻瘟病、優質的黑色糯稻新品系龍黑198。