急性淋巴細胞白血病患兒外周血Netrin-1與血小板水平的相關性及對預后的影響

楊麗娜 欒曉飛 左慧靜 徐榮榮 王 鵬

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一種起源于B系或T系淋巴細胞在骨髓內異常增生的惡性腫瘤性疾病[1]，在兒童急性白血病(acute leukemia，AL)中約占80%，目前其臨床治療方法以化療為主的綜合治療方法[2]。現如今，隨著醫療水平的不斷發展，急性淋巴細胞白血病的預后已得到很大改善，約70%的患兒均能夠得到完全緩解，30%患兒有治愈可能[3]。但是急性淋巴細胞白血病患兒在治療過程中，出血仍然是威脅其生命的重要因素，其中血小板數目的減少程度是評估出血風險的決定因素。李永倩[4]在研究中報道了神經導向因子-1(Netrin-1)表達異常與急性淋巴細胞白血病的發生發展存在密切關系。Netrin-1是一種可溶性神經軸突導向因子，通過吸引與排斥的雙向調節促使軸突往靶向部位正確生長。近幾年，大量研究發現Netrin-1及受體在非神經系統組織外亦有廣泛表達，在乳腺癌、肺癌、結直腸癌等疾病中均有表達上調現象，在腫瘤細胞抗凋亡、增強和遷移中扮演著重要作用[5]。然而，關于Netrin-1在急性淋巴細胞白血病中的相關表達和對預后作用的相關研究卻鮮有報道，因此，本研究通過檢測急性淋巴細胞白血病患兒外周血Netrin-1和血小板水平，并對其相關性和預后做出探究，以期能為臨床尋找新的急性淋巴細胞白血病的危險因素和檢測靶標。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2019年12月期間在我院兒科收治的ALL患兒65例，其中男性37例，女性28例，年齡5～9歲，平均(6.82±2.14)歲；免疫學分型：B系57例，T系8例；危險度分型：高危17例，中危20例，低危28例。另選擇本院同期進行體檢的健康兒童50例作為對照組，其中男性29例，女性21例，年齡4～9歲，平均(6.56±2.62)歲。經檢驗，2組性別、年齡均無統計學差異(P>0.05)。

1.2 納入與排除

(1)觀察組患兒均符合ALL基本診斷標準[6]；(2)年齡≤9歲；(3)患兒家長簽訂知情協議書；(4)排除合并有其他腫瘤性疾病；(5)入試前未接受其他相關治療。

1.3 方法

抽取患兒及受試兒童空腹外周靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min取上清，-80 ℃儲存。采用酶聯免疫吸附(ELISA)法測定血清Netrin-1表達水平，儀器為NDM-9602G 型全自動酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)。采用全自動凝血分析儀(北京九強生物技術股份有限公司)對血小板計數(PLT)、血小板平均體積(MPV)以及血小板分布寬度(PDW)水平進行檢測。檢測所用試劑由美國R&D 公司提供。所有試劑均在有效期內使用，嚴格按照儀器說明書的實驗步驟進行所有操作。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件，計數資料組間構成比、率的比較采用卡方檢驗；計量資料2組間均數比較采用t檢驗，2組以上均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，對計量資料間的相關性進行Pearson檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組Netrin-1及血小板水平比較

觀察組Netrin-1水平顯著高于對照組，PLT水平顯著低于對照組(P<0.05)，MPV、PDW比較無統計學差異(P<0.05)，具體如表1。

表1 2組Netrin-1及血小板水平情況

2.2 Netrin-1水平與ALL患兒各指標的相關性

Netrin-1在不同PLT水平下存在顯著性差異(P<0.05)，但在性別、淋巴結腫大、骨質破壞、腎臟浸潤、復發、染色體異常等臨床指標中無顯著差異(P>0.05)，如表2。

表2 各臨床指標下Netrin-1水平情況

2.3 不同危險度分級ALL患兒Netrin-1水平及血小板水平比較

隨著患兒危險度分級增加Netrin-1水平顯著升高，PLT顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 觀察組各危險分級Netrin-1水平及血小板水平情況

2.4 Netrin-1水平與PLT相關性分析

經Pearson檢驗，Netrin-1水平與PLT呈負相關(γ=-0.034，P=0.019)，其水平越高，患兒PLT水平越低，出血風險越大，預后越差。

3 討論

Netrin-1家族是一類層粘連蛋白相關的可分泌蛋白，是一類重要的神經突起導向因子，在結構上高保守。Netrin-1是Netrin家族中研究較多的重要成員之一，近年來研究顯示，Netrin-1不僅在神經導向、神經遷移和神經可塑性中發揮重要作用，還能引起包括血管和腺管在內的所謂管脈系統生長，甚至可以調節白細胞遷移[7]。高永生等[8]發現Netrin-1與乳腺癌細胞的存活及轉移有關，Netrin-1表達有利于乳腺癌細胞轉移，在乳腺癌中Netrin-1高表達則乳腺癌細胞轉移性強。張旭等[9]在研究中指出Netrin-1在結直腸癌腫瘤內異常表達與腫瘤的發展和轉移有關，當DCC和Netrin-1在同一細胞株內表達呈負相關，DCC蛋白的下調和失活可能與Netrin-1有關。劉鴻運等[10]則在肺癌的研究中指出Netrin-1在肺癌組織中呈陽性表達，在有淋巴結轉移的肺癌組織中表達強烈，Netrin-1可能在肺癌的發生發展中發揮重要作用。張春霞等[11]則認為Netrin-1在體外時增強癌細胞凋亡抗性，在體內時卻能抑制癌細胞生長，這可能與Netrin-1介導的不同受體有關。以上研究均提示Netrin-1在多種腫瘤疾病中呈現表達異常，與腫瘤的發生發展密切相關，其機制可能為Netrin-1通過結合不同依賴性受體，如UNC5B、DCC、Neogenin等，產生不同作用。但是在Netrin-1的研究中相關ALL的研究卻鮮有報道。本研究通過對65例ALL患兒以及50名健康兒童作為對照組的外周血Netrin-1和PLT、MPV和PDW檢測發現：觀察組Netrin-1水平顯著高于對照組，PLT水平顯著低于對照組，而MPV、PDW比較無統計學差異，提示：Netrin-1水平與PLT水平在ALL患兒中表達異常，可能參與了ALL的發生發展過程；而MPV、PDW無統計學差異，可能因為骨髓中原始細胞及幼稚淋巴細胞的極度增生，從而使巨核細胞受到抑制導致血小板的生成減少，但血小板的大小仍較為一致。但是Z等[12]在血小板與急性淋巴細胞白血病的研究中顯示ALL患者MPV水平比正常對照組低，與本研究存在差異，我們分析可能原因為Z等研究中患兒接受化療治療，化療后由于化療藥物對骨髓抑制作用，使MPV、PDW降低。

為了進一步明確Netrin-1與ALL患兒生物學特征之間的相關性，本研究對不同臨床指標性別、淋巴結腫大、骨質破壞、腎臟浸潤、復發、染色體異常、PLT下Netrin-1水平進行對比發現Netrin-1在不同PLT水平下存在顯著性差異，在性別、淋巴結腫大、骨質破壞、腎臟浸潤、復發、染色體異常等臨床指標中無顯著差異。然后，對在臨床指標中存在顯著差異的PLT和Netrin-1在不同危險分級中進行對比顯示：隨著患兒危險度分級增加Netrin-1水平顯著升高，PLT顯著降低，經Pearson檢驗，Netrin-1水平與PLT呈負相關(γ=-0.034)，其具體病理機制目前尚不清楚，可能與Netrin-1增強了白血病細胞侵襲能力有關。An等[13]在研究中指出，Netrin-1可能通過激活MAPK信號通路與P13K信號通路促進白血病細胞惡性增殖與轉移。PLT是直接反映血小板生成與衰亡的動態指標，在ALL中白血病細胞在骨髓和其他造血組織中大量增殖并浸潤其他器官和組織，使正常造血組織受到抑制從而減少了血小板生成[14]。近幾年血小板作為一種非入侵檢查，能有效反映體內血小板的增殖動力學，對ALL早期的診斷、動態療效以及預后觀察具有重要意義。此外，危險度分級也是一個綜合性預后指標，而研究中隨著患兒危險度分級增加Netrin-1水平顯著升高，PLT顯著降低說明：Netrin-1可能是ALL患兒一個預后不良的指標，對ALL患兒預后有一指導意義。

盡管如此，本研究仍存在一定不足之處：①研究中僅納入65例ALL患兒，樣本量較小，存在一定局限性；②未能進一步對Netrin-1分子、基因進行深入研究，無法闡明Netrin-1在ALL患兒中的具體病理機制；③未能在研究中給與患兒相應治療，無法得知在治療后Netrin-1水平變化。以上問題都需我們進行更多基礎研究進行驗證。

綜上所述，急性淋巴細胞白血病患兒外周血Netrin-1水平存在異常表達，與PLT呈負相關，其水平越高，患兒預后越差。