Survivin基因表達及其調控宮頸癌細胞增殖機制的研究

儲小燕 方 洋 黃歐平

宮頸癌是嚴重威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，增殖與轉移依舊是宮頸癌難以治愈的原因，細胞增殖與凋亡的動態平衡是維持機體穩態的重要方式[1]，凋亡抑制使細胞能夠逃脫死亡并有利于惡性轉化[2]。存活蛋白(Survivin，又名BIRC5基因)是1種凋亡抑制蛋白(inhibitor of apptosis protein,IAP)，能夠阻斷細胞凋亡。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中最小的1個成員[3]。目前多項研究表明Survivin基因在正常細胞與癌細胞的表達情況具有顯著的差異性[4]。本研究通過分析臨床宮頸癌患者癌組織及癌旁組織Survivin基因表達水平，了解該基因在宮頸癌組織是否高表達；通過慢病毒載體基因敲減技術，探明Survivin基因敲減后，Hela細胞的增殖能力、侵襲能力及凋亡速率改變情況，從而分析Survivin基因對Hela細胞增殖的調控機制。通過分析Survivin基因對宮頸癌發生發展的調控機制，為臨床早期發現、家族篩查及基因治療宮頸癌等提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 人組織標本的收集

本研究對象為2012至2016年期間在江西省腫瘤醫院婦科治療的宮頸患者的石蠟包埋標本共計30例(其中鱗癌23例，腺體6例，腺鱗癌1例)。臨床分期為Ⅰa～Ⅱa期的早期宮頸癌患者，年齡為28～63歲，中位年齡為(51±3.5)歲，KPS≥90分。宮頸癌患者中行單純性根治性手術19例，術后補充放化療6例，單純補充化療5例。臨床資料：23例鱗癌患者病理分級為G1～G2級16例，G3級7例。6例腺癌G1～G2級4例，G3級2例。按2018年FIGO臨床分期標準術后確診鱗癌中Ⅰa～Ⅱa期18例；Ⅲc1期4例，Ⅲc2期1例；腺癌中Ⅰa～Ⅱa期6例；腺鱗癌中Ⅰa～Ⅱa期1例。選取腫瘤及遠癌組織(離腫瘤邊界5 cm以外，沒有轉移的組織定義為遠癌組織)分別分為A組及B組。每個病人分別以A1/B1，A2/B2，A3/B3......以此類推。

1.2 主要藥品及試劑

Hela細胞購自中科院細胞庫，Trizol試劑盒購自中國上海普飛公司，RNA反轉錄試劑盒與RT-qPCR引物均購自廣州銳博生物科技有限公司，引物序列號如下：GAPDH (F:TGACTTCAACAGCGACACCCA;R:CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA,121bp),BIRC5(F:ACCGCATCTCTACATTCAAG;R:CAAGTCTGGCTCGTTCTC,113bp)。DNA Marker購于TAKARA公司，Code No.D526A；MTT試劑盒購自Genview公司；Transwell試劑盒購于Corning公司，Cat.No.3422；GIEMSA染色液購于Sigma公司，Cat.No.32884；凋亡試劑盒購于eBioscience公司，Cat.No.88-8007。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR檢測Survivin基因在癌組織及遠癌組織中的表達水平 將組織樣品用無菌器械剪碎并勻漿，使用Trizol法提取組織總RNA，分光光度計分析測定所抽提RNA的濃度及質量。使用RNA反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA，使用兩步法進行RT-qPCR。每個樣本設3個復孔，以控制實驗誤差，設GAPDH為內參。

1.3.2 慢病毒載體細胞轉染 構建survivin基因(別名BIRC5基因)慢病毒載體：Easy-siRNA設計目的慢病毒載體(GV248),合成oligo信息,RNAi慢病毒感染Hela細胞，qPCR實驗驗證挑選其最佳敲減靶點慢病毒,慢病毒細胞感染實驗分組及每組病毒用量情況如表1。分析得出基因敲減效率最佳組別，將培養的HELA細胞進行慢病毒介導的BIRC5敲減載體體外轉染，轉染72 h后觀察并拍照。

表1 慢病毒細胞感染實驗分組及病毒用量

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖能力 將經BIRC5基因敲減慢病毒載體轉染的HELA細胞鋪入96孔細胞板培養，分別于第0 h,24 h,48 h,72 h及96 h終止培養，終止培養前4 h加入MTT，4 h后加入DMSO，震蕩25 min后酶標儀490/570 nm檢測OD值進行統計分析。

1.3.4 Transwell實驗檢測細胞遷移能力 將Transwell小試至于24孔培養板中，在上室中加入100 μl無血清培養基，置于37 ℃培養箱中1 h后，移去上室中培養基并加入100 μl提前制備好的細胞懸液，并在下室中加入600 μl30%FBS培養基，同時，使用該細胞懸液鋪一塊MTS 96 孔板，每孔約接種5000 個細胞，接種后即測定OD570，作為轉移參照。37 ℃培養箱中培養后，完全去除小室內培養基，并用棉拭子輕輕移去小室內非轉移細胞，滴入Giemsa染色液染色轉移細胞35 min 后，將小室浸泡沖洗數次，空氣晾干，顯微鏡拍照。于96 孔板空中加入200 μl10%醋酸，揭下底膜，置于醋酸溶解，完全溶解后，吸取100 μl于另一孔中，檢測OD 570值。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡速率 將Hela細胞鋪于6孔細胞培養板培養，至覆蓋率約為70%是藥物有道凋亡。胰酶消化，收集培養孔中所有細胞，充分洗滌后加入Annexin V-APC ，于室溫避光染色10～15 min并上流式細胞儀檢測。每組均設三個復孔。

1.4 統計分析

利用統計軟件graphpad prism 5.0對實驗數據進行總體方差分析及組間配對t檢驗，實驗均重復3次及以上。

1.5 實驗倫理

本研究通過了江西省腫瘤醫院倫理委員會審核，研究所用人體樣本均由患者無償提供，捐獻者對研究知情并簽署知情同意。

2 結果

2.1 Survivin基因在宮頸癌初診早期患者中高表達

分析臨床30例患者癌組織及遠癌組織Survivin基因mRNA水平(圖1)可知，共計73%患者癌組織Survivin基因mRNA水平明顯高于遠癌組織(P<0.05)，其中，15例患者癌組織Survivin基因mRNA水平顯著高于遠癌組織(P<0.01)。

圖1 Survivin基因在宮頸癌患者癌組織及癌旁組織中的表達

2.2 Survivin基因RNAi慢病毒感染Hela細胞效果

如圖2所示，Survivin基因在Hela細胞中明顯表達。如圖3所示，Hela細胞中，相對于NC組，KD1組BIRC5基因敲減效率達到97.3% 。因此可以設定KD1組為其最佳敲減靶點慢病毒。

圖3 BIRC5慢病毒載體轉染HELA細胞的表達情況

2.3 BIRC5慢病毒載體轉染對HALE細胞增殖及凋亡的影響

HALE細胞經BIRC5慢病毒載體轉染后，檢測96h細胞吸光度，測定細胞增殖速率及細胞凋亡率，結果顯示，敲減組(KD)增殖曲線較空細胞對照組(CON)及陰性對照組(NC)平緩，且每個對應時間點其吸光度都低于其他對照組(圖4A)，表明BIRC5基因敲減后，Hale細胞增殖速率持續明顯降低。細胞凋亡統計圖(圖4B)結果顯示，BIRC5基因敲減后，Hale細胞凋亡率顯著增高。

2.4 BIRC5慢病毒載體轉染對HALE細胞遷移能力的影響

Transwell遷移實驗結果(圖5)顯示，BIRC5基因敲減后(KD組)，HALE細胞遷移數量明顯較少，細胞遷移率明顯低于對照組。

圖5 BIRC5慢病毒載體轉染HALE細胞遷移能力

3 討論

宮頸癌是世界第3大婦科惡性腫瘤，近年來發病呈年輕化趨勢。難治性宮頸癌的宮旁浸潤和遠處轉移嚴重影響宮頸癌的治療效果和預后。影響轉移性和復發性宮頸癌的臨床預后主要因素尚未完全揭示。了解癌癥進展相關的分子機制對于尋找更好的難治性宮頸癌的治療至關重要。survivin已被發現在腫瘤進展中起著至關重要的作用，研究表明，survivin基因在非小細胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、甲狀腺癌等中高表達，且survivin陽性表達患者中位生存時間明顯低于survivin陰性表達者,并與淋巴結轉移密切相關。

GAPDH為內參基因

A為MTT檢測細胞增殖；B為流式細胞術檢測細胞凋亡結果統計圖。CON組為空細胞組，NC組為陰性對照組，KD組為敲減組。

并有報道survivin基因在結腸息肉、乳腺炎，角化皮炎及子宮肌瘤中等一些癌前損傷及良性腫瘤組織中高表達，說明survivin基因的表達出現在惡性轉化前期，并可能具有促進這些損傷惡性轉化的作用[5-6]。雖然Survivin抑制細胞凋亡的機制尚不清楚，但Survivin與引發劑或效應caspase的直接和間接結合被認為有助于Survivin抑制細胞凋亡[7]。Caspase-3這種酶能溶解多種蛋白質，誘導細胞死亡,對細胞凋亡有著至關重要的作用[8]，推測Survivin與效應caspase-3的直接結合，但與其他IAP不同，Survivin不具有負責caspase-3與Bir結構域對接的結構部分[9]，一些研究發現乙型肝炎X相互作用蛋白(Hbxip)與procaspase-9前體結合是由Survivin介導的抑制caspase-9的機制[10]，并推測X-連接的IAP(XIAP)也含有BIR結構域，導致Survivin介導caspase-9的抑制[11]。多項研究亦表明caspase-9作為細胞凋亡的啟動子，對于惡性腫瘤也有著重要的作用[12]。然而，survivin基因在宮頸中的作用癌癥還沒有被研究。我們先前的研究首次發現survivin是宮頸癌發展的關鍵因素， 本研究表明，與對照組織相比，survivin在宮頸癌組織中明顯上調，本實驗發現survivin基因在宮頸癌組中高表達；且行survivin基因敲減后可明顯抑制hela細胞的增殖、遷移及侵襲能力，加速癌細胞的凋亡。提示survivin 基因可能在調節宮頸癌浸潤和轉移中起關鍵作用，對宮頸癌的臨床診斷和治療具有重要的意義。