吉非替尼獲得性耐藥非小細胞肺癌患者miR-21、miR-155表達水平及臨床意義

胡 波 朱琰琰 徐 穎

肺癌是我國發病率和死亡率均位居首位的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌的80%以上[1]。早期NSCLC發病隱匿且無明顯臨床表現，導致多數患者初診即為晚期[2]，而絕大多數晚期患者由于多種原因無法耐受手術治療，常導致患者預后不良的發生[3]。吉非替尼是一種表皮生長因子酪氨酸受體抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)，已被證實其能有效延長NSCLC患者生存時間[4]，但大多數患者用藥過程中會發生獲得性耐藥，導致治療失敗，因此對耐藥機制進行深入研究尤為重要。miRNA是一種長度約為20 bp的游離非編碼RNA，研究表明其在多種腫瘤相關疾病中發揮重要作用[5]。相關研究報道miR-21表達水平與NSCLC的發生發展密切相關，可作為NSCLC診斷及預后相關指標應用于臨床，而miR-155在肺癌中的高表達常與腫瘤的復發和轉移相關[6]，但二者在吉非替尼治療過程中發生耐藥的相關分子機制尚不明確。本研究采集吉非替尼獲得性耐藥NSCLC患者血清及組織并檢測相關miRNA表達水平，旨在為解決NSCLC患者吉非替尼獲得性耐藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2013年4月至2016年4月在本院接受吉非替尼治療出現耐藥的晚期NSCLC患者80例作為研究組，耐藥標準參照中華醫學會肺癌臨床診療指南(2018版)[7]。納入標準：①所有患者經細胞學檢查確診為NSCLC，根據TNM分期均為Ⅲ～Ⅳ期；②患者僅接受過吉非替尼單藥治療，未接受過其他靶向治療及生物免疫治療；③無合并其他肺部疾病和腫瘤。未達上述標準的NSCLC患者不納入研究組。研究組中男性49例，女性31例，年齡為41～72歲，平均(57.14±9.33)歲。另選取60例吉非替尼治療效果良好、6個月以上病情無進展NSCLC患者為對照組，其中男性33例，女性27例，年齡為43～71歲，平均(58.25±9.14)歲。本研究中所有患者均簽署知情同意書并經醫院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 RT-PCR檢測技術檢測miRNA-21、miRNA-155水平

所有患者入組第1天無菌采集患者外周血10 ml，3 000 r/min離心10 mim分離血清，于-80 ℃冰箱中低溫儲存。采用Serum RNA Purification Mini Kit試劑盒(加拿大Norgen Biotek公司)提取血清中總RNA，于-80 ℃保存。收集患者支氣管鏡檢采集的腫瘤組織，采用Trizol試劑盒(上海酶聯生物公司)提取總RNA，保存于-80 ℃。所提取RNA使用NanoDrop 2000檢測，其A260/A280>1.8提示樣品合格，使用TaKaRa逆轉錄試劑盒(大連寶生物公司)逆轉錄為cDNA模板備用。

使用SuperScriptTMⅢ One-Step RT-PCR System with PlatinumTMTaq DNA Polymerase試劑盒(美國Thermo Fisher公司)檢測miRNA表達情況。體系中加入2×Reaction Mix 25 μl，正、反向引物各1 μl，cDNA 2 μl，SuperScriptTMⅢ PT/PlatinumTMTaq Mix 2 μl，加入ddH2O至50 μl，反應條件為94 ℃ 預變性2 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、68 ℃ 60 s，共40個循環，結果采用2-??Ct法進行分析。所有引物均委托上海生工生物公司合成，miRNA-21引物：F：5’-AGACATCATACAGAGTGTCG-3’，R：5’-GCATCTAGGATCGACGTG-3’；miR-NA-155引物：F：5’-GCCGCTTAATGCTAATCGT-3’，R：5’-CAGTGCTGGGTCCGACTGA-3’。

1.3 免疫組化檢測肺癌組織中EGFR表達情況

使用SP免疫組化試劑盒(上海酶聯生物公司)檢測NSCLC患者腫瘤組織中EGFR的表達情況，按照染色深度進行評分：未著色0分、淡黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分。再按陽性細胞比例進行評分：≤25%為1分、>25%～50%為2分、>50%～75%為3分、>75%為4分。將上述評分相乘記做總評分，<3分為低表達，≥3分為高表達。

1.4 統計分析

2 結果

2.1 2組患者臨床資料比較

比較結果顯示研究組及對照組患者年齡、性別、是否吸煙、腫瘤組織學類型、癌癥分期及腫瘤分化程度均無明顯差異(P>0.05)，見表1。

表1 2組患者臨床資料比較(例，%)

2.2 2組患者miRNA-21、miRNA-155表達水平差異

經RT-PCR檢測發現研究組血清、組織中miR-21水平及血清miR-155水平明顯高于對照組(P<0.001)，但組織中miR-155水平與對照組相比無統計學差異(P>0.05)，見表2。

表2 2組患者miRNA-21、miRNA-155表達水平比較

2.3 肺癌組織EGFR表達與miRNA-21、miRNA-155水平的關系

免疫組化結果顯示80例吉非替尼獲得性耐藥NSCLC患者組織中EGFR高表達59例，低表達21例。EGFR高表達患者血清、組織中miR-21及血清miR-155水平明顯高于EGFR低表達患者(P<0.05)，而組織中miR-155水平無統計學差異(P>0.05)，見表3。

表3 miRNA-21、miRNA-155與肺癌組織中EGFR的關系

2.4 耐藥組miR-21、miR-155表達水平與患者生存率的關系

采用門診、電話、微信等方式對研究組患者進行隨訪，隨訪間隔3個月，隨訪患者死亡或截止2019年4月終止隨訪。所有死亡患者死因均為肺癌轉移或并發癥。隨訪結果繪制生存曲線，結果發現血清中miR-21、miR-155高表達患者生存率明顯低于低表達患者(χ2=14.179，P<0.001；χ2=18.338，P<0.001)，見圖1A；而組織中miR-21高表達患者生存率明顯低于低表達患者(χ2=12.195，P<0.001)，但miR-155高表達患者生存率較低表達患者相比無統計學差異(χ2=1.162，P>0.05)，見圖1B。

A：血清中miR-21、miR-155水平與患者預后的關系；B：組織中miR-21、miR-155水平與患者預后的關系

3 討論

表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼具有抑制腫瘤血管生成、抑制細胞分裂和促進細胞凋亡的作用[8]，目前研究已經證實其能夠改善晚期NSCLC及轉移性NSCLC患者臨床癥狀并延長患者生存期，適用于化療不耐受和化療失敗的NSCLC患者[9]。但臨床試驗發現大多數吉非替尼治療有效的NSCLC患者在接收治療6個月后會發生不同程度的耐藥，導致治療失敗。相關研究表明EGFR基因二次突變、PI3K/AKT通路過度激活和腫瘤微環境的改變在腫瘤耐藥中發揮重要作用[10-12]，但其具體機制尚需深入研究。

研究發現miR-21在多種腫瘤細胞中高表達，與腫瘤的增殖轉移密切相關，被稱作促癌miRNA[13]，高表達的miR-21調控其下游多個抑癌基因而促進腫瘤的發展。國內學者Dai的研究發現miR-21在NSCLC患者血清中表達水平明顯上升，且miR-21的高表達常與患者預后不良相關[14]，miR-21還能夠通過PI3K/AKT通路調節NSCLC化療的敏感性[15]。故miR-21表達水平可作為患者預后相關指標發揮臨床作用。miR-155在肺癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤中表達水平升高[16]，且miR-155的高表達常與腫瘤耐藥的發生相關。研究表明血清中miR-155高表達的乳腺癌患者曲妥珠單抗治療效果較差[17]；而利妥昔單抗治療彌漫性大B細胞淋巴瘤患者時發現組織中miR-155高表達者常伴隨預后不良的發生[18]。本研究發現研究組血清中miR-21、miR-155表達水平及組織中miR-21水平明顯高于對照組，提NSCLC患者吉非替尼耐藥的發生可能與miR-21、miR-155水平相關，但研究組組織中miR-155水平與對照組相比無統計學差異，可能與患者的特異性及免疫組化評分標準不同相關。

有研究表明EGFR通路能夠調控miR-21水平，尤其在不吸煙的NSCLC患者中EGFR突變上調其磷酸化水平，導致miR-21水平升高抑制細胞凋亡[19]。Li的研究發現miR-21的高表達可能通過PTEN基因調控EGFR-TKI耐藥的發生[20]。而miR-155可能通過NF-κB通路驅動FOXO 3a導致吉非替尼耐藥的發生[21]，但具體機制尚不完全明確。而本研究發現在EGFR高表達患者外周血miR-21、miR-155水平及組織中miR-21水平明顯高于低表達患者，提示EGFR高表達患者可能通過上調miR-21及miR-155水平介導吉非替尼耐藥的發生，而組織miR-155水平無明顯差異可能與患者異質性相關。生存曲線說明血清miR-21、miR-155高表達及組織miR-21高表達患者常伴隨預后不良的發生。

綜上所述，吉非替尼獲得性耐藥NSCLC患者血清中miR-21、miR-155及組織中miR-21水平明顯上升，且與腫瘤組織中EGFR水平相關，生存曲線結果為血清中miR-21、miR-155和組織中miR-21高表達患者生存率明顯低于低表達患者，而組織中miR-155水平與上述指標無關。血清miR-21、miR-155和組織中miR-21水平可能作為相關指標對吉非替尼獲得性耐藥NSCLC患者預后進行評估，但其與吉非替尼獲得性耐藥發生的相關性仍需進一步研究。