miR-21、miR-221、miR-106a在兒童骨肉瘤組織中的表達及臨床意義

申子龍 程富禮 張林鋒

骨肉瘤是最常見的原發性骨癌，主要以危害兒童群體為主。在兒童中骨肉瘤發病率僅次于白血病及淋巴瘤，侵襲性骨肉瘤易出現肺轉移，導致患兒不良結局。近年來外科手術技術和化療方案的不斷優化，骨肉瘤患兒預期壽命和生存質量有了很大的改善，其5年存活率可達70%～80%，但化療藥物長期應用所帶來的并發癥及耐藥問題對患兒長期生存帶來了不利的影響[1-3]。免疫療法是近年來受到廣泛關注的癌癥治療方向，微小RNA(miRNA)是一系列長度大小為18～22個核苷酸的小型非編碼RNA分子，參與多種腫瘤的轉錄后調控過程。miR21、miR-221、miR-106a均是新發現的miRNA分子，其中miR-21被發現參與調控晚期結直腸癌、黑色素瘤及子宮內膜癌的腫瘤免疫進程[4-6]，miR-221被發現可用于原發性肝細胞癌、兒童急性淋巴細胞白血病及甲狀腺的診斷及預后評估[7-9]，此外，miR-106a被證明乳腺癌、胃癌及鼻咽癌的病情判斷具有一定的價值[10-12]，在骨肉瘤組織中，miR21、miR-221、miR-106a表達改變及其臨床價值尚不明確，本研究通過對兒童骨肉瘤組織中miR21、miR-221、miR-106a表達改變及其與臨床病理參數的關聯進行分析，旨在為該病的臨床診療及免疫靶點開發提供有價值的研究基礎，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇本院骨科2017年3月至2020年3月收治兒童骨肉瘤患者40例作為研究對象，術中收集其病理組織，置于-80 ℃冰箱中凍存，通過電子病歷調查收集研究組患者臨床資料，包括性別、年齡、發病部位、Enneking臨床分期及是否發生肺轉移情況。納入標準：①均經術中病理診斷為骨肉瘤。②年齡≤14周歲。③均為首次接受治療，術前未進行化療及其他治療。④臨床資料完整。排除標準：①監護人不同意參加研究者。②治療中途退出研究或轉院者。③治療中途意外死亡者。選擇同期醫院收治的多指畸形患者20例其軟骨組織作為對照組，兩組對象在性別、年齡等一般資料方面比較無差異(P>0.05)。

1.2 miR-21、miR-221、miR-106a的免疫組化檢測

采用免疫組化法檢測miR-21、miR-221、miR-106a在組織中的表達情況，具體步驟：保存的骨肉瘤組織經常規石蠟切片后，經過烘干、脫蠟、水化、檸檬酸緩沖液抗原修復后，使用PBS緩沖液進行沖洗，滴加3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗后滴加山羊抗體進行孵育，快速甩干后滴加分別滴加miR-21、miR-221、miR-106a抗體(北京中杉金橋公司)，4 ℃孵育過夜。PBS緩沖液沖洗后向組織切片滴加二抗，37 ℃孵育30 min，采用DAB試劑盒(武漢博士德公司)顯色5 min，沖洗干凈后蘇木精復染3min，清洗干凈，梯度酒精進行脫水，二甲苯透明3 min，晾干后使用中性樹膠進行封片。

1.3 結果判定

染色完成后由病理科經驗豐富的醫師在顯微鏡下對細胞染色特征進行分類，未著色細胞標記為陰性，淡黃色、棕黃色細胞為陽性標志。根據切片的陽性細胞比例及著色深度進行計分，以半定量法統計結果，視野下陽性細胞百分率判定：0分：>5%，1分：5%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：>75%。陽性細胞著色深度判定：0分：無色或與背景色重疊，1分：淺棕黃色，2分：棕黃色，3分：棕褐色，將細胞陽性百分率判定得分與著色深度判定得分相乘結果為免疫組化染色評分。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 兒童骨肉瘤組織及正常軟骨組織中miR-21、miR-221、miR-106a的表達比較

免疫組化分析結果表明，兒童骨肉瘤組織中miR-21、miR-221、miR-106a的相對表達顯著高于正常軟骨組織，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兒童骨肉瘤組織及正常軟骨組織中miR-21、miR-221、miR-106a的表達比較

2.2 骨肉瘤組織miR-21、miR-221、miR-106a表達與臨床病理參數的關系

骨肉瘤組織miR-21、miR-221、miR-106a表達與Enneking臨床分期及肺轉移有關(P<0.05)，與性別、年齡及發病部位無關(P>0.05)，見表2。

表2 miR-21、miR-221、miR-106a表達與骨肉瘤臨床病理參數的關系

2.3 骨肉瘤組織中miR-21、miR-221、miR-106a表達對骨肉瘤的預測價值

多元Logistic回歸分析結果表明，在校正性別、年齡、發病部位和肺轉移等混雜性因素后，miR-21、miR-221、miR-106a水平升高仍是骨肉瘤發病的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 骨肉瘤組織中miR-21、miR-221、miR-106a表達對骨肉瘤的預測價值

3 討論

流行病學調查結果表明，OS在20歲以下青少年及兒童中發病率約3.2/1 000 000，其中男性發病率明顯高于女性。肺轉移是影響OS患兒預后的主要不利因素，發生肺轉移的患兒生存率可由65%～70%降低至19%～30%，在未發生肺轉移前對該病的防治較為困難[13-14]。目前研究認為OS發病原因包括表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)和CAK激酶組配因子(menage a trois，MAT1)等腫瘤突變累積、年齡、性別、激素水平及輻射暴露等與OS發病存在緊密關聯，而免疫因素則是導致OS發病的主要深層次原因[15-16]。

以免疫調節劑、巨噬細胞活化劑和樹突狀細胞治療等為代表的免疫靶向治療在OS中已有一定的應用，但其臨床療效不一，因此需開發新的分子靶點，用于OS的臨床治療。miRNA在體內發揮的免疫功能具有多效性，對腫瘤存在雙向調控作用，且對機體對于化療藥物的敏感性存在一定的影響。miR-21主要位于染色體17q23.2上，既往研究證實了miR-21可與PTEM、TPM1、PDCD4等基因相結合的方式影響腫瘤的發展過程[17-18]。miR-221定位于X染色體P11.3上，主要通過與miR-222結合的方式影響下游免疫反應，并最終對腫瘤的增殖過程產生影響[19]。miR-106a屬于miR-17家族，屬于miR-106a-363基因簇中的重要致癌部分，研究發現，miR-10a可通過調控腫瘤細胞凋亡及膜轉運蛋白表達的方式影響腫瘤的發展并參與腫瘤耐藥過程[20]。體外實驗發現，miR-21、miR-221、miR-106a mRNA在骨肉瘤細胞中水平顯著上調[21-22]，本研究調查了miR-21、miR-221、miR-106a兒童骨肉瘤組織中的表達，結果顯示與正常軟骨組織相比，骨肉瘤組織中miR-21、miR-221、miR-106a的表達顯著增加，表明miR-21、miR-221、miR-106a可能參與了兒童骨肉瘤的發病過程。本研究分析了骨肉瘤組織miR-21、miR-221、miR-106a表達與臨床病理參數的關系，結果表明，miR-21、miR-221、miR-106a均在Enneking臨床分期為ⅡB、Ⅲ期水平高于I、IIA期水平，而發生肺轉移的骨肉瘤患者，其骨組織中miR-21、miR-221、miR-106a也明顯高于未發生骨轉移的骨肉瘤患者，提示miR-21、miR-221、miR-106a可能與兒童骨肉瘤的病程發展及骨轉移有關。

骨肉瘤的確診及臨床分期、病理學分型等的確定需要借助病理科專業人員的幫助，存在一定的主觀性，而受限于檢查條件、醫師水準等因素的限制，骨肉瘤診斷的不準確、不及時可能造成病情延誤的問題。本研究結果證明了miR-21、miR-221、miR-106a可能參與了兒童骨肉瘤的疾病發展及轉移過程，其機制有待進一步研究。