加味六安煎對咳嗽變異性哮喘模型豚鼠白細胞介素-4、白細胞介素-13水平及氣道重塑相關基因表達的影響

張寧寧 吳力群 陳海鵬 霍婧偉 徐方蔚 廖欣婷 李盼盼 路晨 陳宇航

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)是一種以咳嗽為主要或唯一臨床表現的特殊類型的哮喘，是中國兒童慢性咳嗽的主要原因[1]。本病兒童雖無明顯喘息、氣促等表現，常因遇冷空氣或者運動后加劇，反復發作，若不及時治療易發展為哮喘，嚴重影響患兒的學習生活和身心健康。加味六安煎是臨床治療兒童咳嗽的有效方劑[2]，課題組前期通過大鼠實驗研究發現，本方可通過調整CVA大鼠模型體內的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)及白細胞介素(interleukin，IL)-5水平從而減輕炎性細胞浸潤及水腫程度，減輕咳嗽次數[3]。同時通過調整基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)與基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1, TIMP-1) MMP-9/TIMP-1的平衡從而有效減輕氣道重塑[4]。本實驗擬通過加味六安煎對CVA豚鼠模型血清及支氣管肺泡灌洗液(brocho-alveolar larage fluid, BALF)中IL-4、IL-13水平及氣道重塑相關基因轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β) mRNA、MMP-9 mRNA表達的影響，進一步探討其治療CVA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康4周齡純系雄性豚鼠30只，清潔級，體質量250～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。許可證號：SCXK(京2016-0011)。

1.2 實驗藥品

加味六安煎藥物組成：法半夏6 g、橘紅6 g、茯苓6 g、杏仁6 g、白芥子6 g、甘草3 g、海浮石20 g、葶藶子6 g、瓜蔞10 g、膽南星4 g、炒萊菔子10 g，低、中、高劑量組分別配制成濃度為0.74 g/mL、1.48 g/mL、2.22 g/mL的溶液。藥物由北京中醫藥大學東方醫院制劑室制備；孟魯司特鈉(杭州默沙東制藥有限公司產品，規格：4 mg/片)，用生理鹽水制成混懸液，于4℃冰箱保存。藥品由北京中醫藥大學東方醫院中藥房及康仁堂藥業提供；卵蛋白(ovalbumin,OVA)(批號: 421C033, Solarbio公司)；氫氧化鋁(批號: 20131125，國藥集團化學試劑有限公司)；辣椒素(純度>95%，批號: P12D9S77366, 源葉生物有限公司)。

1.3 造模與分組

將30只健康豚鼠采用隨機數字表法分為6組，每組5只。正常對照組、CVA模型組、孟魯司特鈉組、加味六安煎低劑量組、加味六安煎中劑量組、加味六安煎高劑量組。采用OVA和氫氧化鋁激發致敏并用OVA激發的方法復制CVA模型豚鼠。正常飼養3天后開始實驗，除正常對照組外，其余各組均在第1、8天每只豚鼠腹腔注射10%OVA和氫氧化鋁混合溶液1 mL致敏。從第15天起，模型組及各給藥組豚鼠置于密閉有機玻璃罩內，給予含1%OVA 溶液的生理鹽水超聲霧化激發2分鐘，每天一次，共10天。激發時觀察豚鼠反應， 如出現咳嗽、豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔、腹肌抽動、極度煩躁等現象中兩種或兩種以上者，或抽搐、虛脫現象之一者，判定為造模成功。

1.4 給藥方法與劑量

各組給藥劑量按人與豚鼠體表面積換算公式計算。激發之日起，即從實驗的第15天開始，用霧化器激發前30分鐘，各組分別灌胃給藥干預，共治療10天。正常對照組：不作處理。CVA模型組：灌服生理鹽水1.7 mL·100 g-1·d-1，每日1次。孟魯司特鈉組：灌服孟魯司特鈉混懸液1.2 mg/kg，每日1次。加味六安煎低劑量組：灌服低濃度加味六安煎溶液，1.7 mL·100 g-1·d-1，每日1次。加味六安煎中劑量組：灌服中濃度加味六安煎溶液，1.7 mL·100 g-1·d-1，每日1次。加味六安煎高劑量組：灌服高濃度加味六安煎溶液，1.7 mL·100 g-1·d-1，每日1次。加味六安煎低、中、高劑量組分別配制成濃度為低濃度(0.74 g/mL)、中濃度(1.48 g/mL)、高濃度(2.22 g/mL)的溶液，分別相當于體重70 kg成人用量的5倍、10倍、15倍。連續灌胃10天。第26天，取左側肺上葉組織做病理和免疫組化檢測。

1.5 一般狀態觀察

觀察各組豚鼠的飲食、飲水、睡眠、毛發及活動等，測量豚鼠的體質量、飲食等，觀察豚鼠的死亡只數及死亡時間。在造模藥物干預的過程中，模型組一只豚鼠在霧化過程中發生喘息及痙攣一次，予硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑干預后好轉。各組豚鼠的飲食及飲水狀況良好，毛發顏色光亮，正常對照組精神狀態最佳。模型組及各治療組因均予藥物致敏及霧化吸入干預，霧化過程中可聞及不同程度的咳嗽，其中以模型組咳嗽次數最多且咳聲響亮。各組豚鼠體質量較均勻。

1.6 標本采集

豚鼠予10 mg/kg水合氯醛腹腔注射進行麻醉，腹主動脈取血，將豚鼠處死，夾板固定后打開胸腔，行氣管插管術后結扎右肺，使用PBS溶液分3次行支氣管肺泡灌洗，每次2 mL PBS溶液，并回收BALF，隨即快速結扎左側肺門，取左側肺上葉組織立刻置于凍存管內，迅速移入-80℃液氮凍存。

1.7 ELISA法檢測血清及BALF中IL-4及IL-13水平

股動脈取血5 mL，以3000 r/分鐘，離心10分鐘，分離血清；以3000 r/分鐘,離心后留取上清液置-20℃凍存。按照相關試劑盒提供方法操作。

1.8 Real time-PCR法檢測肺組織及BALF中TGF-β mRNA及MMP-9 mRNA的表達。

將樣本分別用液氮研磨粉碎，加入1 mL Trizol(invitrogen)，吸取到1.5 mL EP管中，加入500 μL酚氯仿，振蕩混勻，靜止5分鐘，置于離心機中于4℃離心十分鐘，小心吸取上層上清于一新的離心管中，加入700 μL異丙醇，混勻，于4℃12000 rpm離心10分鐘，小心去上清，用75%乙醇洗滌一次，晾干，溶于50 μL DEPC處理水中，電泳檢測提取總RNA。使用核酸濃度測定儀測定RNA濃度和純度。反轉錄使用invitrogen的反轉錄試劑盒superscript III。Real time PCR反應體系建立后，將其混勻，瞬離，置于熒光定量PCR儀上，進行反應及循環擴增。擴增反應結束后建立PCR產物的溶解曲線，每個樣本分別用待檢測基因和內參基因引物擴增，每個反應重復3次。引物信息：actin：上游引物5’-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3’,下游引物 5’-GGGTTTCCCGTTGATGACC-3’；TGF-β：上游引物5’-GTCCTTGCCCTCTACAACCAAC-3’,下游引物5’-CTGCTCCACCTTGGGCTTG-3’；MMP-9：上游引物5’-GTAACCCTGGTCACCGGACT-3’,下游引物5’-GTAACCCTGGTCACCGGACT-3’。數據采用2-△△CT法計算。

1.9 膠原面積及膠原沉積率檢測

處死豚鼠后取出肺組織放入10%甲醛中固定，石蠟包埋，切片，Masson染色。

肺組織常規Masson染色后，采用Image J圖像處理軟件分子各組肺組織膠原纖維表達，并計算膠原面積、組織總面積及膠原容積分數(collagen volume fraction,CVF)，CVF=膠原面積/組織總面積×100%。

1.10統計學方法

2 結果

2.1 加味六安煎對CVA模型豚鼠血清及BALF中IL-4水平的影響

血清：與正常對照組相比，模型組IL-4水平降低(P<0.05)；與模型組相比，孟魯司特鈉組IL-4呈升高趨勢，但無明顯統計學差異(P>0.05)，加味六安煎各劑量組IL-4水平升高(P<0.05)；各治療組間無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

BALF：與正常對照組相比，模型組IL-4水平降低(P<0.05)；與模型組相比，孟魯司特鈉組IL-4呈升高趨勢，加味六安煎各劑量組呈降低趨勢，但無明顯統計學差異(P>0.05)；各治療組間無明顯統計學差異(P>0.05)。見表1。

2.2 加味六安煎對CVA模型豚鼠血清及BALF中IL-13水平的影響

血清：與正常對照組相比，模型組IL-13水平升高(P<0.05)；與模型組相比，孟魯司特鈉組呈降低趨勢，但無明顯統計學差異(P>0.05)，加味六安煎各治療組IL-13水平均降低(P<0.05)；與孟魯司特鈉組相比，加味六安煎各劑量組IL-13水平降低(P<0.05)；加味六安煎各劑量組間無明顯統計學差異(P>0.05)。見表1。

BALF：與正常對照組相比，模型組IL-13水平升高(P<0.05)；與模型組相比，孟魯司特鈉組IL-13呈降低趨勢，但無明顯統計學差異(P>0.05)，加味六安煎各治療組IL-13水平均降低(P<0.05)；與孟魯司特鈉組相比，加味六安煎各劑量組IL-13水平降低(P<0.05)；加味六安煎各劑量組間無明顯統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組CVA模型豚鼠血清及BALF中IL-4、IL-13水平比較

2.3 加味六安煎對CVA模型豚鼠肺組織及BALF中TGF-β及MMP-9 mRNA表達的影響

2.3.1 TGF-β mRNA的表達 肺組織：與正常對照組相比，模型組中的TGF-β mRNA表達水平升高(P<0.05)；與模型組相比，孟魯司特鈉組呈降低趨勢，但無明顯統計學差異(P>0.05)，加味六安煎各治療組TGF-β mRNA表達水平均降低(P<0.05)；與孟魯司特鈉組相比，加味六安煎各劑量組TGF-β mRNA表達水平降低(P<0.05)；加味六安煎各劑量組間無明顯統計學差異(P>0.05)。BALF：與正常對照組相比，模型組中的TGF-β mRNA表達水平升高(P<0.05)；與模型組相比，各治療組TGF-β mRNA表達水平均減低(P<0.05)，各治療組間無明顯統計學差異(P>0.05)。見表2。

2.3.2 MMP-9 mRNA的表達 肺組織：與正常對照組相比，模型組中的MMP-9 mRNA表達水平升高(P<0.05)；各治療組MMP-9 mRNA表達水平均減低(P<0.05)，各治療組間無明顯統計學差異(P>0.05)。BALF：與正常對照組相比，模型組中的MMP-9 mRNA表達水平升高(P<0.05)；與模型組相比，孟魯司特鈉組呈降低趨勢，但無明顯統計學差異(P>0.05)，加味六安煎各治療組MMP-9 mRNA表達水平均降低(P<0.05)；與孟魯司特鈉組相比，加味六安煎各劑量組MMP-9 mRNA表達水平降低(P<0.05)；加味六安煎各劑量組間無明顯統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組CVA模型豚鼠血清及BALF中TGF-β mRNA及MMP-9 mRNA表達的比較

2.4 加味六安煎對CVA模型豚鼠氣道重塑程度的影響

2.4.1 膠原面積 經單因素方差分析，F=15.826，P<0.01(P=0.000)，可以認為6組豚鼠膠原面積不完全相同。與正常對照組相比，模型組膠原面積明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，孟魯司特鈉組及加味六安煎各劑量組膠原面積減小，且有統計學差異(P<0.05)；與孟魯司特鈉組相比，加味六安煎各劑量組膠原面積均有不同程度的減小，且有統計學差異(P<0.05)，加味六安煎各劑量組組間相比無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

2.4.2 組織總面積 經單因素方差分析，F=1.343，P=0.280(P>0.05)，6組豚鼠組織總面積無顯著性差異。見表3。

2.4.3 膠原容積分數 經單因素方差分析，F=21.699，P<0.01(P=0.000)，可以認為6組豚鼠CVF不完全相同。與正常對照組相比，模型組CVF明顯升高，且有統計學差異(P<0.05)；與模型組相比，孟魯司特鈉組及加味六安煎各劑量組CVF均有不同程度降低(P<0.05)；與孟魯司特鈉組相比，加味六安煎各劑量組CVF均有不同程度降低(P<0.05)；加味六安煎各劑量組之間無顯著性差異(P>0.05)。見表3及圖1。

表3 各組CVA模型豚鼠膠原面積、組織總面積及CVF比較

3 討論

在中醫學中，CVA多被歸為“風咳”“哮咳”范疇，病位在肺，病因多責之于風、痰、虛、瘀，中醫藥治療本病具有較好的優勢[5]。基于小兒肺脾不足的生理特點，課題組認為肺脾氣虛、痰飲伏肺為本病的基本病機。小兒肺常不足，衛外不固，腠理疏松，易為外邪侵襲，故而往往內外相合而為病。加味六安煎全方由法半夏、橘紅、茯苓、杏仁、白芥子、甘草、海浮石、葶藶子、瓜蔞、膽南星、炒萊菔子組成，清熱瀉肺，健脾化痰。本病往往反復發作，遷延不愈，所謂“久病入絡，痼病必瘀”，正如唐容川在 《血證論》中提出 “一切不治之癥，終以不善祛瘀之故……瘀血內蓄可使久病纏綿不愈”，故而加桃仁、地龍、丹參等活血通絡之品，臨證辨治顯效。有研究表明，活血化瘀法可以通過調節VEGF的表達從而調節新生血管的生成[6]。同時有臨床研究表明，CVA患兒的VEGF表達水平明顯升高，增加了血管的通透性，影響著細胞外基質的改變，進而影響CVA患兒的氣道重塑[7]。故而CVA氣道重塑與“瘀”密切相關，在治療本病時，活血化瘀通絡法當得到重視。

注：A 正常對照組；B 模型組；C 孟魯司特鈉組；D 加味六安煎低劑量組；E 加味六安煎中劑量組；F 加味六安煎高劑量組。

雖然本病的具體發病機制尚未明確，但與哮喘有共同的病理基礎，其中氣道炎癥和氣道重塑是兩個重要方面。IL-4及IL-13是導致本病氣道炎癥的重要因子。IL-4由T淋巴細胞亞群Th2及嗜酸性粒細胞分泌，位于易引起哮喘發生的核酸區段(5q31-5q33和5q23-5q31)[8]，可以通過轉錄Fc RII mRNA，從而表達Fc RII，進而合成IgE，可以介導肥大細胞、B細胞增殖，促進IgM向IgE轉換，聯合集落刺激因子表達血管內皮細胞黏附分子，從而促進氣道嗜酸性粒細胞炎癥浸潤和損傷[9]，是導致本病慢性炎癥的重要細胞因子之一，對于調節體內的免疫應答具有重要的作用[10]。本次研究發現CVA模型組豚鼠的血清及BALF中IL-4水平低于正常對照組，加味六安煎低、高劑量組血清IL-4水平有所升高。似乎與既往多數研究矛盾，這可能與多種因素相關。第一，CVA相當于哮喘的隱匿期，從激發造模即日至給藥治療干預，CVA豚鼠可能處于“平穩期”，此時期的IL水平紊亂程度較輕，可能與正常對照組相當。豚鼠對于致敏原的敏感性較高，在以后的實驗研究中，考慮以給藥為時間節點，對CVA豚鼠的急性激發狀態和“平穩期”的IL-4水平進行比較。第二，可能與樣本采集有關，本次研究發現CVA模型組BALF中的IL-4水平較血清中的水平高，在激發狀態下，炎癥因子聚集于肺組織局部，氣道白介素水平可能異常，而外周血中特異性炎癥細胞水平下降。從而血清中IL-4水平下降。隨著時間的推移，炎癥因子逐漸擴散到外周血液循環中，故可能會有所升高。與CVA模型組相比，加味六安煎各劑量組BALF中的IL-4水平雖無統計學差異，但均呈降低趨勢，由此可見IL-4在CVA模型豚鼠局部肺組織的含量與外周血中的含量存在明顯的差異，且經治療后BALF中的IL-4水平降低程度比血清更明顯。此外，培養條件、時間等多種條件也可能是影響IL檢測的因素。IL-13是由Th2細胞產生，是參與氣道炎癥反應的中藥細胞因子[11]。同時，既往有研究[12-13]表明，IL-13是重要的誘導黏液分泌的上游細胞因子，可誘導嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞等趨化，促進B細胞產生IgE，從而刺激氣道上皮杯狀細胞分泌黏液，并可以誘導支氣管平滑肌細胞分泌VEGF[14],在氣道重塑的過程中也發揮著重要的作用。在本研究中，CVA模型組的IL-13的水平較正常對照組明顯升高，與既往研究具有一致性，由此可見IL-13對CVA氣道黏液分泌程度及氣道重塑程度有重要的影響。經過給藥治療后，孟魯司特鈉組IL-13水平與模型組無顯著性差異，加味六安煎各劑量組IL-13水平較模型組及孟魯司特鈉組降低，由此可見加味六安煎對IL-13水平的降低程度較孟魯司特鈉組明顯，其中以加味六安煎中劑量組降低最明顯。

氣道重塑在慢性氣道炎癥的基礎上，隨著炎癥的遷延和反復加重，在多種炎癥細胞及其釋放出的細胞因子和炎癥介質的作用下，氣道上皮發生基底膜增厚、腺體肥大增生、平滑肌增生肥厚和新血管形成等病理改變。TGF-β、MMP-9是氣道重塑重要生物標志物[15]。MMP-9屬于細胞外蛋白酶家族，可以降解細胞外基質，同時又可以促進氣道平滑肌的增殖，并促進上皮細胞分泌TGF-β。TGF-β是一種促纖維細胞生長因子，可引起氣道上皮纖維化，平滑肌增生，微血管改變，黏液分泌增加。本次研究發現模型組肺組織及BALF中TGF-β mRNA和MMP-9 mRNA的表達水平升高，加味六安煎可以降低二者的表達，基本與既往研究相符。

膠原沉積增加是氣道重塑的重要病理表現[16]。在本次研究中，CVA模型組的膠原面積和CVF較正常對照組增加，各治療組的膠原面積及CVF均有降低，且加味六安煎各劑量組的膠原面積及CVF均較孟魯司特鈉組有不同程度的降低，提示加味六安煎對于CVA豚鼠氣道重塑的改善程度優于孟魯司特鈉組。基礎數據比較，加味六安煎中劑量組對膠原面積及CVF的減低程度最明顯。既往本課題組對CVA模型Wistar大鼠進行了初步研究[17]，發現各治療組間對于膠原沉積程度的改善程度無統計學差異，加味六安煎各劑量組組間比較，高劑量組對于膠原沉積的改善情況最明顯，這可能與Wistar大鼠與豚鼠對治療藥物的敏感性差異有關，由此可見CVA模型豚鼠比CVA模型Wistar大鼠對治療藥物更敏感。

綜上，加味六安煎治療CVA可能通過調節IL-4和IL-13水平，進而調整Th1/Th2的平衡狀態，減輕氣道炎癥程度；并通過調節TGF-β mRNA和MMP-9 mRNA的表達，減輕氣道膠原沉積狀態，進而改善氣道重塑。