基于PI3K/Akt/mTOR信號通路探討玉屏風散對肥大細胞脫顆粒的影響

韋薇 覃驪蘭 李莉 鄭偉灝

過敏性疾病(allergic disease)反復發作且難以根治已經成為全球最受關注的公共衛生問題之一[1]。據世界變態反應組織統計，近30年來，過敏性疾病的發生率至少增加了3倍，目前全球總患病率已達22%。近年來，特異性生物標志物、信號與蛋白相關機制是過敏學科的研究熱點[2]。肥大細胞是過敏性疾病發病的主要效應細胞，存在于機體的大多數組織如皮膚、呼吸道、黏膜、腹腔中，被抗體激活的肥大細胞脫顆粒后產生的炎性介質與細胞因子會參與多種炎癥免疫性疾病如過敏反應、哮喘等，所以肥大細胞脫顆粒機制在過敏性疾病的發展進程中起到關鍵性作用[3-7]。研究發現調控白細胞介素信號與磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases, PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，PKB/Akt)信號通路，與治療過敏性疾病密切相關[8-10]。目前，現代醫學治療此病主要以控制疾病癥狀為主，無法有效緩解反復發作，而且副作用明顯[11]，而中醫藥治療過敏性疾病有著獨特的優勢，療效顯著，且副作用較小?，F代研究表明玉屏風散在治療哮喘、鼻炎、蕁麻疹等過敏性疾病都有顯著療效[12-14]，且玉屏風散可以顯著減輕肥大細胞脫顆粒，可以通過抑制肥大細胞脫顆粒相關作用機制來治療過敏性疾病[15-17]。因此，本研究通過建立體外肥大細胞脫顆粒模型，來驗證玉屏風散發揮抗過敏反應的作用是否與肥大細胞脫顆粒作用機制和PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

玉屏風散浸膏：根據2015版《中華人民共和國藥典(一部)》玉屏風項下提取方法，按3∶1∶1比例取黃芪600 g、防風200 g、白術200 g，將200 g防風予以碎斷，加4倍量的水浸泡2小時，蒸餾提取5小時，另收集蒸餾后的水溶液，將蒸餾后的藥渣與600 g黃芪、200 g白術一起煎煮2次，第一次1.5小時，第二次1小時，合并煎液，過濾，濾液濃縮至適量，加適量乙醇至含醇量70%，攪拌，靜置，過濾，濾液加壓回收乙醇，加入揮發油及蒸餾后的水溶液，濃攪拌，靜置，取上清液，過濾，濾液濃縮得156.611 g浸膏量(1 g浸膏含6.3852 g生藥)，置-20°冰箱保存備用。

黃芪、防風、白術(廣西仙茱中藥科技有限公司，批號：20190101、2019040、20190602)；胰酶(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：52419)；CCK-8(新賽美生物科技有限公司，批號：N9091085)；小鼠單抗PI3K(武漢三鷹生物技術有限公司，批號：60225-1-Ig)，兔多抗p-PI3K(Abcam公司，批號：Ab182651)；兔多抗Akt(Bioss公司，批號：Bs-0115R)；p-Akt(Affinity公司，批號：AF0016)；兔多抗mTOR(武漢三鷹生物技術有限公司，批號：20657-1-AP)；p-mTOR(CST公司，批號：5536t)；β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase, β-Hex)、組胺、白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-13、血小板激活因子(platelet activating factor, PAF)酶聯免疫分析試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：202004)；Trizol(Ambion公司，批號：15596-026)；HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1054)。

1.2 細胞株與分組

小鼠肥大細胞瘤P815購自中國科學院干細胞庫，編號：SCSP-516。細胞狀態為部分懸浮、部分貼壁生長。使用高糖伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco modified Eagle medium,DMEM)培養基，含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，1%雙抗。培養于37℃、5%CO2培養箱中，待細胞密度達到80%～90%時，調整相應的細胞數量進行傳代，取對數生長期的細胞用于后續實驗。將P815細胞隨機分為4組：空白組、模型組、玉屏風散高劑量組、玉屏風散低劑量組。

1.3 儀器設備

細胞恒溫培養箱(美國Thermo公司)；生物安全柜(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯科技公司)；Epoch2T型吸收光酶標儀(美國BioTek儀器有限公司)；全自動細胞計數儀(伯樂生命醫學產品有限公司)；離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.4 CCK-8測定P815細胞存活率

將玉屏風散浸膏用不含血清高糖DMEM培養基按稀釋為1.5625 μg/mL、3.125 μg/mL、6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 7個濃度梯度，置于4℃冰箱保存。取對數生長期的P815細胞，用DMEM培養液(無血清)按1×105/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL。設置空白組(培養基)、對照組(細胞、培養基)、給藥組(細胞、培養基、玉屏風散)，每組設置5個復孔。饑餓處理24小時使其同步化后，吸走每孔內原培養液，給藥組分別加入100 μL含終濃度(1.5625 μg/mL、3.125 μg/mL、6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)的玉屏風散DMEN培養液，空白組、對照組加入等體積無藥DMEM培養液，置于恒溫培養箱繼續孵育。24小時后，吸走各孔內培養液，每孔加入含10% CCK-8的培養液，37℃，5% CO2繼續孵育1.5小時，利用酶標儀測定各孔在波長450 nm 處的吸光度(optical delnsity，OD)值，重復3次[18-19]。

計算各濃度組細胞存活率，細胞存活率%=(實驗組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)×100%。

1.5 酶聯免疫吸附法檢測β-Hex、組胺等炎性因子水平

取對數生長期的P815細胞計數，用無血清培養基稀釋成5×105/mL 密度的單細胞懸液，接種到6孔板上，設置空白組、模型組、玉屏風散高劑量組(25 μg/mL)、玉屏風散低劑量組(12.5 μg/mL)，每組設置3個復孔，每孔2 mL，置 37 ℃，5% CO2細胞培養箱中，培養24小時。待細胞至80%融合度，于細胞空白組加入等體積DMEM培養液；細胞模型組用等體積DMEM培養液代替受試藥物，玉屏風散高、低劑量組分別加入不同濃度的藥物，繼續培養在 37℃，5% CO2飽和濕度的細胞培養箱中，在藥物作用6小時后，模型組、玉屏風散高劑量組與玉屏風散低劑量組加入500 μL胰蛋白酶(終濃度1 μg/mL)刺激，空白組加入等體積的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，分別收集刺激l小時后的細胞上清液與細胞，上清液用來檢測β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase, β-Hex)、組胺、IL-4、IL-13、PAF等細胞因子的分泌情況，孔板壁上的細胞用于后續提取蛋白[20]。細胞上清液嚴格按照酶聯免疫分析試劑盒操作步驟，記錄各細胞因子吸光度值。

1.6 Western blot法檢測PI3K、Akt、mTOR蛋白及其磷酸化的表達

將1.5步驟收集到的6孔板細胞，使用PIPA裂解液進行裂解提取蛋白，蛋白定量變性后，各蛋白以上樣量40 μg使用SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，電轉至PVDF膜，使用5%脫脂牛奶封閉，1%的BSA封閉磷酸化蛋白，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2小時，采用凝膠成像系統拍照，用IPP對灰度值進行分析，使用GAPDH作為內參。

1.7 實時熒光定量PCR法檢測PI3K、Akt、mTOR蛋白表達量

收集1.5收集到的細胞，使用 Trizol 法提取細胞總 RNA ，并反轉錄成 cDNA，以 cDNA 為模板，進行實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)實驗檢測各組細胞的PI3K、Akt、mTOR在mRNA水平上的表達，引物序列如表1。相對表達量運用2-ΔΔCt法計算。

表1 引物序列

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 玉屏風散對P815細胞存活率的影響

對比其他組，玉屏風散在25 μg/mL濃度以下時，P815細胞存活率達到80%以上，無明顯抑制作用，50 μg/mL濃度以上存活率低于80%，50 μg/mL與100 μg/mL濃度兩組對比其他5組有顯著差異，差異有統計學意義(P<0.01)。如圖1。

圖1 不同濃度玉屏風散對P815細胞存活率比較

2.2 玉屏風散對β-Hex、組胺等炎性因子水平的影響

胰酶刺激P815肥大細胞脫顆粒后，對比空白組，模型組細胞上清液中的β-Hex、組胺、IL-4、IL-13、PAF濃度都有顯著上升，差異有統計學意義(P<0.01)；對比模型組，玉屏風散高劑量組與玉屏風散低劑量組的β-Hex、組胺、IL-4、IL-13、PAF濃度顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。如表2。

表2 玉屏風散對各炎性因子濃度的影響

2.3 玉屏風散對PI3K、Akt、mTOR及其磷酸化蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組、玉屏風散高劑量組和玉屏風散低劑量組PI3K、Akt、mTOR表達變化都無明顯差異(P>0.05)磷酸化后的p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達變化有顯著差異，且差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，玉屏風散高劑量組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)，玉屏風散低劑量組p-PI3K無明顯變化，p-Akt、p-mTOR表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。如表3、圖2。

表3 玉屏風散對PI3K、Akt、mTOR及其磷酸化蛋白表達的影響

2.4 玉屏風散對PI3K、Akt、mTOR蛋白表達量的影響

胰酶刺激P815肥大細胞活化脫顆粒后，與空白組比較，模型組PI3K、Akt、mTOR基因的相對表達量顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，玉屏風散高劑量組與玉屏風散低劑量組PI3K、Akt、mTOR基因的相對表達量顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.01，P<0.05)。如表4。

注：A 空白組；B 模型組；C 玉屏風散高劑量組；D 玉屏風散低劑量組

表4 玉屏風散對PI3K、Akt、mTOR蛋白表達量的影響

3 討論

實驗結果表明，玉屏風散可以降低肥大細胞中β-Hex、組胺、IL-4、IL-13、PAF炎性因子水平，并對PI3K、Akt、mTOR蛋白的表達有調節作用，說明了玉屏風散是通過抑制肥大細胞活化脫顆粒釋放炎性因子來減輕過敏反應，其作用機制與PI3K/Akt/mTOR信號轉導通路有關。

過敏性疾病在新生兒到老年人的各個年齡階段都可能會發生，主要包括皮膚過敏反應、呼吸道過敏反應、消化道過敏反應等。過敏反應發病機制主要由免疫球蛋白介導，抗原(Ag)可以通過交聯的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)E結合肥大細胞上的特異性親和受體(FcεRI)，激活肥大細胞內部進行一系列磷酸化反應和炎癥因子合成，使細胞內鈣離子濃度升高，導致肥大細胞脫顆?；⑨尫沤M胺、β-Hex、前列腺素(prostaglandins，PGs)和白三烯(leukot-rienes，LTs)、PAF等炎性介質；Ag也可以通過交聯的IgG結合肥大細胞上的特異性親和受體(FcγRIII)刺激肥大細胞產生PAF。PAF可凝聚和活化血小板使之釋放組胺等，增強過敏反應，PAF和組胺主要通過誘導平滑肌收縮和增加血管通透性引起過敏反應癥狀[21-25]。另一種現代研究認為，過敏反應是一種由輔助型T細胞2(T helper 2 cell，Th2)細胞因子引發的免疫系統失調疾病，Th2細胞主要產生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等細胞因子，介導體液免疫應答[26]。IL-4、IL-13與過敏反應密切相關，IL-4、IL-13可以激活B細胞產生IgE。研究表明，哮喘、變應性鼻炎發作過程中被活化的免疫細胞會釋放IL-4、IL-13等炎性介質，引起支氣管收縮、血管通透性增加等炎癥反應[27]。IL-4可以啟動肥大細胞分化，IL-13可促進IL-4的作用，兩者共同作用，促使并加重炎癥的形成與發展。因此，抑制這幾種炎癥性因子是治療過敏性疾病的有效途徑。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是參與炎癥的發生、發展的重要信號通路，也是重要的細胞內途徑之一。PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，能夠調節眾多細胞內信號級聯的激活，以及多種炎癥介質功能的發揮, 在PI3K下游的直接作用靶點是蛋白激酶Akt，也是最關鍵的靶酶，負責傳遞PI3K相關的生物信息。PI3K 的脂類激酶活性，可以催化Akt磷酸化，磷酸化的Akt從細胞質轉移到細胞膜上，通過直接和間接兩種途徑激活底物mTOR蛋白，調節下游細胞生長、增殖和炎癥靶基因的表達[28]。在靶細胞水平上，通過PI3K可誘導合成內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)，由eNOS催化產生的一氧化氮可加劇過敏反應。有研究表明，通過影響PI3K的表達，抑制Akt與mTOR的磷酸化水平，可以減輕炎癥反應的發生與發展[29-30]。

肥大細胞脫顆粒試驗是過敏反應模型常用的一種方法。彭博[31]在相同刺激條件下比較P815和RBL-2H3細胞激活后脫顆粒反應差異，結果發現P815細胞是活化后脫顆粒時間出現更早、程度更高的細胞。人皮膚肥大細胞在體外釋放類胰蛋白酶是一種新型的肥大細胞特性，而被釋放的類胰蛋白酶再通過特異性受體激活相鄰的肥大細胞，通過相關機制再次誘導相鄰肥大細胞組胺釋放，從而產生肥大細胞的“瀑布效應”[32]。隋麗[5]和吳賢波[20]在體外培養P815細胞后，均采用胰蛋白酶激發誘導肥大細胞脫顆粒來檢測相關分子機制。

玉屏風散最早記載于《丹溪心法》，由黃芪、防風、白術三味藥組成，具有益氣固表、扶正祛邪之功效。其用藥量精少而配伍嚴謹，白術健脾益氣，脾旺則土可生金，使肺氣充足，衛陽以固，與黃芪為伍，則益氣固表之力更宏，故用以為臣。防風走表，祛風以散風邪，合黃芪、白術則益氣散邪，為佐使之用。本方中黃芪得防風則固表不留邪，防風得黃芪，祛邪不傷正，實為補中有散，散中寓補之方[33]。許多藥理學研究表明了玉屏風散可通過調節機體免疫功能和相關通路以發揮臨床療效，并初步探索了玉屏風散通過多種作用機制與相關信號通路對機體產生的抗炎抑菌、免疫調節、穩定微生態環境及抗腫瘤、抗纖維化等功能。但是對玉屏風散作用機制的研究仍不夠系統、深入，玉屏風散作為治療過敏性疾病的經典方劑，如果可以闡明其抗過敏作用機制，將會為中醫藥防治過敏性疾病提供更多新思路。