基于凋亡機制院內制劑抗瘤丸優化方-4對U87裸鼠移植瘤動物模型實驗研究

馮英楠 陳菲 王曉萌 王海征 林曉蘭

膠質瘤是中樞神經系統最常見的一類腫瘤，約占顱內所有腫瘤的35.26%～60.9%[1]。膠質瘤具有侵襲性生長、惡性程度高等特點。目前，治療神經膠質瘤主要采取手術為主，輔助放療、化療等方法，但是膠質瘤生存期短，死亡率高，對人類健康威脅極大。中藥因其較好的安全性和有效性在腫瘤的治療中發揮積極作用，抗瘤丸是適用于腦膠質瘤、腦垂體瘤的輔助治療的院內制劑，臨床應用近30年，服用的患者累計10萬余人次，于2012年獲得國家發明專利(專利號：ZL 2010 1 0234220.2)。

課題組前期研究也證實，抗瘤丸的抑制神經膠質瘤細胞作用可能與誘導膠質瘤細胞的凋亡相關[2-3]，提示對治療膠質瘤有良好的開發和應用前景。抗瘤丸優化方-4是抗瘤丸的優化處方之一，基于前期優化處方研究[4-5]發現，本實驗的抗瘤丸優化方-4抑瘤效果較好，故本實驗進一步對抗瘤丸優化方-4進行研究。抗瘤丸優化方-4是在原方的基礎上，通過中醫藥專家論證，減少了6味佐使藥。本實驗通過觀察對相關指標表達的影響，進一步闡明抗瘤丸優化方-4治療膠質瘤的作用機制，為抗瘤丸處方優化提供數據，為進一步開發抗瘤丸提供相關的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物與細胞

SPF級健康雄性BALB/c裸鼠，雄性，體質量17～19 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001；人神經膠質瘤U87細胞(株)，購于中國協和醫科大學基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心(ATCC，CCL-107)。

1.2 藥物

抗瘤丸是由白花蛇舌草、半枝蓮、白英等18味中藥組成的院內復方制劑。抗瘤丸優化方-4是抗瘤丸的優化處方，由首都醫科大學宣武醫院藥劑科提供。陽性對照藥替莫唑胺(批號：H20080313)，購于美國先靈葆雅制藥公司。

1.3 試劑及儀器

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(批號：20120517)，購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；DMEM培養基(高糖)(批號：1177237)、胰蛋白酶(批號：0458)、無鈣、鎂磷酸鹽緩沖液(10×PBS，PH 7.2-7.4)(批號：20120815)，均購于北京諾博萊德科技有限公司；注射用青霉素鈉(批號：Y0302215)、注射用硫酸鏈霉素(批號：030103)，購于華北制藥股份有限公司；CD34抗體、兔抗人原始造血細胞單克隆抗體(批號：12620110)，購于北京中衫金橋生物技術有限公司；VEGF抗體、rabbit IgG(批號：10CM199)，購于武漢博士德生物工程有限公司；二抗、(H+L)/HRP辣根酶標記山羊抗兔(批號：K126816A)、DAB濃縮顯色液、A液和B液(批號：ZLI-9018)、原位末端標記(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(批號：12469600)，均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

6500型CO2培養箱(美國NAPCO)，TE2101L型電子天平(德國賽多利斯)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，DM3000顯微鏡(德國Leica)。

1.4 人神經膠質瘤U87細胞的培養方法

U87細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置37℃、5%CO2的培養箱中，培養基2～3天更換一次，倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況。當細胞生長至70%～80%融合時進行傳代，用0.25%胰蛋白酶消化液進行消化傳代，將培養基倒掉，用PBS洗兩遍，加消化液室溫下消化，倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞開始變圓，細胞間隙變大時，加入10%胎牛血清的DMEM培養基終止消化，用吸管輕輕吹打瓶底和瓶壁，按1瓶傳3瓶的比例接種，3到4天傳代一次。

1.5 模型制備

將U87細胞(5×107個細胞/只)接種到裸鼠(2只)右側腋窩、20天瘤塊長至2 cm(直徑)，無菌剝離腫瘤成2 mm×2 mm×2 mm，用套管針將瘤塊移植至裸鼠(10只)右側腋窩，用火棉膠將切口粘住。17～19天再次長至2 cm(直徑)，無菌剝離腫瘤成1 mm×1 mm×1 mm，再次移植裸鼠右側腋窩，用火棉膠將切口粘住。

1.6 分組與給藥

待動物體內瘤塊長至80～180 mm3時，將裸鼠按瘤塊大小和體質量采用分層隨機抽樣方法分為：模型組、陽性藥(替莫唑胺)對照組、抗瘤丸優化方-4高、中、低劑量組，每組12只。抗瘤丸優化方-4高、中、低劑量組藥物濃度分別為3.4 g、1.7 g、0.85 g生藥/kg，替莫唑胺膠囊藥物濃度為43 mg/kg。各藥物組按25 mL/kg灌胃給藥，模型組給予等體積去離子水，每天1次，連續給藥20天。

1.7 指標檢測

給藥20天后處死裸鼠，取各組裸鼠的瘤塊，CD34免疫組化法染色，Weidner法計數微血管密度(microvascular density，MVD)；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)免疫組化法染色，圖像分析測定灰度值。TUNEL法檢測凋亡細胞，計算腫瘤細胞凋亡率。

1.7.1 MVD檢測 取出經10%福爾馬林固定，每組隨機取3個瘤塊，常規石蠟包埋、切片(每個腫塊切3張片子：第1切片取腫瘤最外側邊緣，第2切片取腫瘤正中，第3切片取前兩切片中間位置，厚度為4 μm)。CD34：(1)切片在65℃烤箱中烤片2小時，常規脫蠟至水后PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(2)3% H2O2室溫下孵育10分鐘，阻斷內源性過氧化物酶，PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(3)0.01M檸檬酸緩沖液(PH=6.2)中進行抗原熱修復，高壓鍋中高溫高壓修復2小時，自然冷卻后PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(4)室溫下5%山羊血清封閉非特異性背景10分鐘，PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(5)分別加CD34一抗(抗體用PBS稀釋，稀釋倍數1∶100)和VEGF一抗(抗體用PBS稀釋，稀釋倍數1∶20)，4℃孵育過夜，PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(6)物素化羊抗兔IgG(二抗)，37℃孵育30分鐘，PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(7)DAB顯色3～5分鐘，蘇木精復染2分鐘，清水沖洗干凈，鹽酸酒精快速分化，清水返藍5分鐘，逐級梯度酒精脫水、二甲苯透明，樹脂封片。

MVD計數參照Weidner法如下：先在100倍下觀察整個切片，每張切片找出3個微血管密集區，血管內皮細胞被染成棕色，然后在200倍鏡下計數被CD34染色的微血管數目。微血管判斷標準如下：與鄰近的微血管、腫瘤細胞及其它結締組織成份不相連的、標記清晰的內皮細胞及內皮細胞簇均可作為一個可計數的微血管。同一微血管的內皮細胞，如染色清晰且相互分離，也可作為單獨的微血管計數。血管腔及腔內紅細胞的存在不是確認微血管的必備條件，對管腔直徑大于8個紅細胞或管壁有平滑肌存在的血管不進行計數。

1.7.2 VEGF灰度值檢測 VEGF免疫組化染色程序同CD34，每組選9張切片，用Leica DM顯微鏡在同一條件下觀察，每張切片上隨機選3個視野，通過Leica CAMER圖像采集系統(Lecia Qwin V3)采集圖像，分析測定每個視野內30個免疫陽性反應的灰度值。VEGF陽性判定如下：VEGF為細胞漿著色，染色陽性以細胞漿呈棕色顆粒狀為標準，且著色明顯高于背景。灰度分為0～256級，反映不同的免疫陽性反應著色強弱。測量所得灰度值越小，陽性表達越強。

1.7.3 細胞凋亡率檢測 取材、包埋、切片同CD34和VEGF，石蠟包埋切片后采用TdT介導的TUNEL法檢測凋亡細胞，具體操作按說明書進行。具體步驟如下：(1)切片常規脫蠟，二甲苯浸洗5分鐘×2次，梯度乙醇浸洗3分鐘×1次；(2)PBS漂洗2次，用proteinase K工作液處理組織15～30分鐘；(3)PBS漂洗2次，加入制備TUNEL反應混合液(處理組用50 μL TdT+450 μL熒光素標記的dUTP液混勻，模型組僅加50 μL熒光素標記的dUTP液，陽性對照組先加入100 μL DNase I，反應10分鐘，后面步驟同處理組；(4)加50 μL TUNEL反應混合液(模型組僅加50 μL熒光素標記的dUTP液)于標本上，加蓋玻片在暗濕盒中37℃反應1小時；(5)PBS漂洗3次，加50 μL converter-POD于標本上，加蓋玻片在暗濕盒中37℃反應30分鐘；(6)PBS漂洗3次，加50 μL DAB底物，反應在10分鐘；(7)PBS漂洗3次，蘇木素復染，常規脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

TUNEL染色切片觀察與分析:在Leica光學顯微鏡下觀察TUNEL染色，每組共取9個切片，每張切片在200倍視野下選取3個視野，計數TUNEL陽性細胞數和正常細胞數。凋亡細胞可見核中有棕褐色顆粒，凋亡細胞體積縮小，染色體斷裂成核碎片，形成膜包裹性的凋亡小體，正常細胞核呈藍色。統計凋亡陽性細胞所占的比例，計算腫瘤細胞凋亡率。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各組U87裸鼠腫瘤組織MVD檢測

與模型對照組比較，抗瘤丸優化方-4低劑量組、陽性藥對照組的MVD值明顯降低(P<0.05)。經免疫組化法染色顯示，CD34低表達。見表1、圖1。

圖1 各組U87裸鼠腫瘤組織中CD34的表達(DAB，×200)

表1 給藥20天后各組U87裸鼠腫瘤組織MVD比較

2.2 各組U87裸鼠腫瘤組織VEGF檢測

與模型對照組比較，抗瘤丸優化方-4高、中、低劑量組、陽性藥對照組移植瘤灰度值明顯增高(P<0.05)。經免疫組化法染色顯示，VEGF低表達。見表2、圖2。

圖2 各組U87裸鼠腫瘤組織中VEGF的表達(DAB，×200)

表2 給藥20天后各組U87裸鼠腫瘤VEGF灰度值比較

2.3 各組U87裸鼠腫瘤細胞凋亡率檢測

與模型對照組比較，上述給藥組細胞凋亡率顯著增高 (P<0.05)。經TUNEL染色，模型對照組可見少量呈棕褐色的凋亡細胞，抗瘤丸優化方-4高、中、低劑量組、陽性藥對照組可見大量的凋亡細胞，具有明顯的促進腫瘤細胞凋亡的作用。見表3、圖3。

表3 給藥20天后各組U87裸鼠腫瘤細胞凋亡率比較

圖3 各組U87裸鼠腫瘤組織中的凋亡細胞TUNEL染色(×200)

3 討論

中醫認為膠質瘤的發生與痰濕凝聚、氣滯血瘀、肝腎不足密切相關，主要治療法則是活血化瘀、扶正培本、健脾補腎、化痰軟堅[6]。抗瘤丸是由18味中藥組成的院內制劑，其中君藥具有清熱利濕、活血化瘀的功效。臣藥配伍君藥起到清熱解毒，豁痰開竅的功效。白英等清熱利濕，解毒消腫；川貝母等潤肺祛痰開胸，利肺氣，通調水道以使痰濕下行；炒山楂等健脾開胃，可消食化積散瘀，防君臣之藥傷及脾胃。全方配伍共奏清熱解毒，活血化瘀，化痰散結之功。前期臨床研究表明，KLW可延長惡性膠質瘤患者的生存時間，具有肯定療效，且價格低廉，有較好的開發價值和前景[7]。

MVD是指生物組織如皮膚、肌肉、器官等組織中單位密度的微血管數量。MVD在臨床上應用于惡性組織微血管新生、侵襲性以及預后評估的診斷，可以反映腫瘤的生長轉移[8]。VEGF是腫瘤血管生成的重要因子，與腫瘤發生、發展、轉移有密切關系[9]。王奕丹等[10]研究MVD與膠質瘤的惡性程度呈正相關,與患者的術后生存時間呈負相關。李娜等[11]研究通過下調VEGF表達，抑制了新生血管的生成，阻斷其營養供應，抑制腫瘤增殖，進而發揮其抑制腫瘤侵襲轉移的作用。抗瘤丸中白花蛇舌草、半枝蓮、白英等成分已有大量的藥理學實驗證明了抗瘤機制。其中白花蛇舌草可以促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增值[12]；半枝蓮能抑制腫瘤血管生成與轉移[13]；白英可通過調控VEGF相關信號通路誘導A549細胞的凋亡[14]。實驗結果顯示，抗瘤丸優化方-4能夠抑制VEGF的表達，降低MVD，從而抑制腫瘤組織新生血管形成，同時可以促進腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，抗瘤丸優化方-4對膠質瘤有一定的作用效果，其作用機制可能與促進腫瘤細胞凋亡，抑制VEGF的表達相關，為抗瘤丸的進一步開發提供實驗依據。