中藥翻白草黃酮類化學成分及其降糖活性研究*

高 穎，盧寅飛，張一笑，龐家樂，張春平

(徐州醫科大學藥學院，江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004)

糖尿病被認為是嚴重威脅人類健康的一種疾病，它也是最為熟知的系統紊亂性疾病。糖尿病會使患者出現高血糖與高血壓癥狀，致死率較高僅次于心血管疾病，惡性腫瘤。中藥在治療糖尿病具有多靶點、多途徑特性，研究表明許多中藥黃酮類化合物在治療糖尿病及其并發癥方面具有顯著療效，主要是具有促使胰島細胞恢復、降低血清和血漿膽固醇、改善糖耐量等[1]作用從而來改善糖尿病癥狀，臨床常用于治療2型糖尿病。

翻白草為薔薇科植物委陵菜屬植物翻白草的干燥全草，作為古典藥集中治療糖尿病有顯著療效的中藥，能有效降血糖，還能消炎袪腫、清熱解毒[2]。現代藥理學研究表明，翻白草總黃酮能通過改善胰島素抵抗、提高胰島素敏感、改善糖脂代謝紊亂，調節相關酶的活性、基因表達和細胞免疫等機制來發揮降低血糖的作用[3]。為拓展翻白草的應用范圍，完善其藥理學作用及臨床應用，使其藥用價值得到充分利用，科研工作者應對其化學成分及相應藥理活性進行系統、全面的研究。翻白草藥物的標準化應用將為糖尿病患者帶來幫助。因此本文將主要對翻白草黃酮類化合物進行研究，對其降糖活性進行評價，為擴大藥源提供合理可靠的科學依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料及細胞株

實驗所用材料經徐州醫科大學張春平副教授鑒定為薔薇科植物翻白草的全草。細胞株：人肝癌細胞(HepG2)，購自Cobioer公司，由徐州醫科大學藥理學實驗平臺惠贈。

1.2 實驗儀器

JMTC-400/SS核磁共振儀，日本JEOL；RE-2000A旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；WFH-203B紫外分析儀，杭州齊威有限公司；SHZ-95B循環水式多用真空泵；SW-CJ-1F超凈工作臺；3111恒溫CO2培養箱，美國Thermo Scientific公司；Elx808酶標儀，美國BioTek公司。

1.3 試 劑

DMEM培養基(貨號：C11965500BT)，Life公司；萄糖測試盒(貨號：F006)，南京建成生物工程研究所；IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG(H+L)(貨號：V926-32211)，Vicmed公司；提取分離使用的試劑為上海凌峰化學試劑有限公司提供的分析純試劑；鹽酸二甲雙胍>99%(貨號：MB1927)，美侖生物技術有限公司；重組人胰島素(貨號：MB3848)，美侖生物技術有限公司。

2 方 法

2.1 提取分離

取翻白草全草5 kg，加入10 L 95%乙醇進行加熱回流提取三次后，藥渣繼續加入10 L 70%乙醇加熱回流提取三次，提取物合并得232 g粗浸膏。以2 L 60 ℃熱水分散，以2 L×3的石油醚，乙酸乙酯，正丁醇依次進行萃取，得石油醚部位(62.9 g)，乙酸乙酯部位(100.8 g)，正丁醇三個部位(68.3 g)。其乙酸乙酯組分與正丁醇組分經硅膠柱層析分離，使用氯仿-甲醇進行梯度洗脫，經薄層色譜檢測，合并相似流分，共得到10個組分。反復經過硅膠柱色譜、Sephadex L-20凝膠柱色譜、MCI凝膠柱色譜分離和純化，得到化合物1～13。利用核磁共振和質譜進行結構鑒定。

2.2 細胞培養

正常的HepG2細胞為貼壁生長細胞，常規培養于含10%血清的DMEM培養基中，5% CO2，37 ℃恒溫培養箱中培養。

2.3 實驗分組

按照實驗處理條件在HepG2細胞的葡萄糖消耗情況實驗中將細胞試驗分為4組：空白組(N組)，用高糖(30 mmol/l)培養基處理48 h；實驗組，用含誘導劑和不同濃度化合物(1 mg/L，L組；10 mg/L，M組；100 mg/L，H組)的培養基共同處理48 h。在胰島素抵抗實驗中以10-7μmol/L胰島素建立胰島素抵抗模型，同樣將細胞分為四組，即：N組，H組，M組和L組。Western-blot實驗中，以10 mg/L二甲雙胍(DMBG)干預細胞作為陽性藥物對照，將實驗分為五組：N組，H組，M組，L組和陽性藥對照組。

2.4 葡萄糖含量檢測

化合物處理48 h后，吸取上清液10 μL，用葡萄糖試劑盒測定培養液中葡萄糖的濃度。

3 結 果

3.1 化合物結構鑒定

化合物1：黃色粉末，易溶于甲醇和二甲亞砜。ESI-MS：m/z：271[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.84(1H，s，OH-5)，10.67(1H，s， OH-7)，10.29(1H，s，OH-4’)，7.92(2H，d，J=8.7 Hz，H-2’，6’)，6.98(2H，d，J=8.7 Hz，H-3’，5’)，6.83(1H，s，H-3)，6.49(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)。13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)：163.9(C-2)，102.8(C-3)，181.7(C-4)，161.2(C-5)，98.7(C-6)，164.2(C-7)，93.8(C-8)，157.2(C-9)，103.5(C-10)，121.4(C-1’)， 128.5(C-2’，6’)， 115.8(C-3’，5’)， 161.0(C-4’)。數據與文獻報道[4]基本一致，因此確定該化合物為芹菜素。

化合物2：黃色粉末，易溶于甲醇和二甲亞砜。ESI-MS：m/z：287[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.94(1H，s，OH-5)，10.77(1H，s，OH-7)，10.08(1H，s，OH-4’)，9.42(1H，s，OH-3’)，7.45～7.49(2H，m，H-2’，6’)，6.93(1H，d，J=8.7 Hz，H-5’)，6.73(1H，s，H-3)，6.47(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.15(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)。13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)：164.3(C-2)，102.7(C-3)，181.3(C-4)，161.2(C-5)，98.7(C-6)，164.4(C-7)，93.6(C-8)，157.5(C-9)，103.5(C-10)，121.4(C-1’)，113.5(C-2’)，145.9(C-3’)，149.6(C-4’)，115.8(C-5’)，119.1(C-6’)。數據與文獻報道[4-5]基本一致，因此確定該化合物為木犀草素。

化合物3：黃色粉末，易溶于甲醇和二甲亞砜。ESI-MS：m/z：287[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.43(1H，s，OH-5)，10.76(1H，brs，OH)，10.06(1H，brs，OH)，9.32(1H，brs，OH)，8.05(2H，d，J=8.4 Hz，H-2’，6’)， 6.95(2H，d，J=8.4 Hz，H-3’，5’)，6.45(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.15(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)。13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)：146.9(C-2)，136.1(C-3)，176.1(C-4)，160.8(C-5)，98.7(C-6)，164.1(C-7)，93.7(C-8)，156.9(C-9)，103.5(C-10)，121.5(C-1’)，129.8(C-2’，6’)，115.9(C-3’，5’)，159.6(C-4’)。以上數據與文獻報道[5,6]基本一致，因此確定該化合物為山柰酚。

化合物4：黃色粉末，易溶于二甲亞砜。ESI-MS：m/z：449[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.60(1H，s，OH-5)，10.84(1H，s，OH-7)，10.14(1H，s，OH-4’)，8. 06(2H，d，J=9.0 Hz，H-2’，6’)，6. 87(2H，d，J=9.0 Hz，，H-3’，5’)，6.43(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.42(1H，d，J=7.2 Hz，H-1’’)，3.07～3.83(m)為糖質子信號；13C-NMR(MDSO-d6，100 MHz)：156.3(C-2)，133.3(C-3)，177.4(C-4)，156.3(C-5)，98.3(C-6)，164.4(C-7)，93.8(C-8)，161.4(C-9)，104.8(C-10)，121.7(C-1’)，131.0(C-2’，C-6’)，115.5(C-3’，C-5’)，160.2(C-4’)，101.9(C-1’’)，74.2(C-2’’)，77.8(C-3’’)，70.8(C-4’’)，76.4(C-5’’)，60.9(C-6’’)。數據與文獻報道[7]基本一致，因此確定該化合物山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物5：黃色無定形粉末，易溶于甲醇和二甲亞砜。ESI-MS：m/z：463[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.6(1H，s，OH-5)，8.03(2H，d，brs，H-2’，6’)，6.85(2H，brs，H-3’，5’)，6.37(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.16(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.43(1H，d，J=7.2 Hz，H-1’’)，3.15～3.82(m)為糖質子信號；13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)：156.5(C-2)，133.3(C-3)，177.5(C-4)，161.2(C-5)，98.8(C-6)，164.6(C-7)，93.9(C-8)，156.7(C-9)，103.7(C-10)，120.8(C-1’)，131.0(C-2’，6’)，115.3(C-3’，5’)，160.2(C-4’)，101.5(C-1”)，75.5(C-2”)，76.1(C-3”)，71.7(C-4”)，73.8(C-5”)，171.2(C-6”)。以上數據與文獻報道[7]的數據基本一致，因此確定該化合物為山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

化合物6：黃色無定形粉末，易溶于甲醇和二甲亞砜。ESI-MS：m/z：449[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.88(1H，s，OH-5)，10.82(1H，s，OH-7)，10.01(1H，s，OH-4’)，8.06(2H，dd，J=8.5 Hz，J=2.0 Hz，H-2’，6’)，6.90(2H，dd，J=8.5 Hz，2.0 Hz，H-3’，5’)，6.43(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.42(1H，d，J=7.2 Hz，H-1’’)，3.12～3.85(m)為糖質子信號。13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)：156.3(C-2)，133.2(C-3)，177.4(C-4)，160.9(C-5)，98.8(C-6)，164.1(C-7)，93.8(C-8)，156.4 (C-9)，103.7(C-10)，120.8(C-1’)，130.9(C-2’，6’)，115.0(C-3’，5’)，160.2(C-4’)，101.7(C-1”)，71.2(C-2”)，73.1(C-3”)，67.2(C-4”)，75.8(C-5”)，60.1(C-6”)。以上數據與文獻報道[8]的基本一致，因此確定該化合物為山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷。

化合物7：黃色粉末，易溶于甲醇和二甲亞砜。ESI-MS：m/z：419[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.5(1H，s，OH-5)，10.8(1H，s，OH-7)，10.3(1H，s，OH-4’)，8.03(2H，dd，J=8.7 Hz，2.0 Hz，H-2’，6’)，6.86(2H，dd，J=8.7 Hz，2.0 Hz，H-3’，5’)，6.42(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.13(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.27(1H，d，J=1.8 Hz，H-1’’)，3.13～3.85(m)為糖質子信號。13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)：155.9(C-2)，133.2(C-3)，177.4(C-4)，161.2(C-5)，98.9(C-6)，161.3(C-7)，93.7(C-8)，156.1(C-9)，103.7(C-10)，120.6(C-1’)，131.1(C-2’，C-6’)，115.2(C-3’，C-5’)，160.1(C-4’)，101.3(C-1’’)，71.4(C-2’’)，70.7(C-3’’)，66.3(C-4’’)，64.3(C-5’’)。以上數據與文獻報道[8]的基本一致，因此確定該化合物為山柰酚-3-O-ɑ-L-阿拉伯糖苷。

化合物8：黃色粉末，易溶于甲醇和二甲亞砜。ESI-MS：m/z：449[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.65(1H，s，OH-5)，10.80(1H，s，OH-7)，9.69(1H，s，OH-4’)，9.25(1H，s，OH-3’)，7.29(1H，d，J=2.0 Hz，H-2’)，7.25(1H，dd，J=8.3 Hz，2.0 Hz，H-6’)，6.86(1H，d，J=8.3 Hz，H-5’)，6.35(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.25(1H，d，J=1.3 Hz，H-1’’)，3.12～3.95(m)為糖質子信號，0.83(3H，d，J=6.0 Hz，Rha-CH3)；13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)：157.8(C-2)，134.3(C-3)，177.9(C-4)，161.5(C-5)，98.7(C-6)，164.3(C-7)，93.5(C-8)，156.5(C-9)，104.1(C-10)，121.2(C-1’)，115.6(C-2’)，145.2(C-3’)，148.5(C-4’)，115.6(C-5’)，120.9(C-6’)，101.9(C-1”)，70.1(C-2”)，70.6(C-3”)，71.2(C-4”)，70.3(C-5”)，17.5(C-6”)上述數據與文獻報道[9]基本一致，故鑒定為槲皮苷。

化合物9：黃色粉末，易溶于甲醇和二甲亞砜。ESI-MS：m/z：465[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.52(1H，s，OH-5)，7.57(1H，d，J=2.0 Hz，H-2’)，7.59(1H，dd，J=8.7 Hz，2.0 Hz，H-6’)，6.83(1H，d，J=8.7 Hz，H-5’)，6.46(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.44(1H，d，J=7.2 Hz，H-1’’)，3.15～3.82(m)為糖質子信號；13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)：156.7(C-2)，133.8(C-3)，177.9(C-4)，161.7(C-5)，99.1(C-6)，164.5(C-7)，94.1(C-8)，156.5(C-9)，104.3(C-10)，121.6(C-1’)，115.9(C-2’)，145.1(C-3’)，149.1(C-4’)，117.0(C-5’)，121.3(C-6’)，101.3(C-1”)，74.1(C-2”)，76.9(C-3”)，70.6(C-4”)，78.0(C-5”)，61.5(C-6”)上述數據與文獻報道[7]基本一致，故鑒定為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物10：黃色粉末，易溶于甲醇和二甲亞砜。ESI-MS：m/z：465[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.46(1H，s，OH-5)，7.69(1H，d，J=2.0 Hz，H-2’)，7.54(1H，dd，J=8.5 Hz，J=2.0 Hz，H-6’)，6.90(1H，d，J=8.5 Hz，H-5’) 6.72(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.40(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.20(1H，d，J=7.2 Hz，H-1’’)，3.16～3.82(m)為糖質子信號；13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)：147.7(C-2)，136.2(C-3)，176.2(C-4)，160.9(C-5)，99.1(C-6)，162.8(C-7)，94.3(C-8)，156.2(C-9)，104.7(C-10)，120.2(C-1’)，116.8(C-2’)，147.9(C-3’)，145.3(C-4’)，115.8(C-5’)，121.1(C-6’)，101.6(C-1”)，73.8(C-2”)，76.5(C-3”)，70.5(C-4”)，77.9(C-5”)，61.6(C-6”)上述數據與文獻報道[7]基本一致，故鑒定為槲皮素-7-O-β-D吡喃葡萄糖苷。

化合物11：黃色粉末，易溶于甲醇和二甲亞砜。ESI-MS：m/z：479[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.6(1H，s，OH-5)，7.62(1H，d，J=2.1 Hz，H-2’)，7.45(1H，dd，J=8.9 Hz，2.1 Hz，H-6’)，6.85(1H，d，J=8.9 Hz，H-5’)， 6.42(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.46(1H，d，J=7.2 Hz，H-1’’)，3.15～3.89(m)為糖質子信號；13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)：156.8(C-2)，133.7(C-3)，177.5(C-4)，161.5(C-5)，99.3(C-6)，164.8(C-7)，94.1(C-8)，157.0(C-9)，104.2(C-10)，121.3(C-1’)，116.0(C-2’)，145.3(C-3’)，149.2(C-4’)，117.1(C-5’)，121.9(C-6’)，101.9(C-1”)，76.3(C-2”)，76.7(C-3”)，72.1(C-4”)，74.3(C-5”)，171.0(C-6”)上述數據與文獻報道[7]的基本一致，故鑒定為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

化合物12：黃色無定形粉末，易溶于甲醇和二甲亞砜。ESI-MS：m/z：317[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.46(1H，s，OH-5)，10.68(1H，s，OH-7)，9.49(1H，s，OH-4’)，9.37(1H，s，OH-3)，7.78(1H，d，J=2.0 Hz，H-2’)，7.70(1H，dd，J=8.7 Hz，2.0 Hz，H-6’)，6.93(1H，d，J=8.7 Hz，H-5’)，6.46(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，3.85(3H，s，OCH3)。13C-NMR(MDSO，100 MHz)：177.9(C-4)，161.1(C-5)，155.9(C-9)，148.6(C-4’)，147.5(C-2)，135.8(C-3)，98.1(C-6)，163.7(C-7)，93.5((C-8)，102.8(C-10)，121.7(C-1’)，111.4(C-2’)，147.2(C-3’)，115.4(C-5’)，121.8(C-6’)，55.6(OCH3)。上述數據與文獻報道[9]的異鼠李素一致，故鑒定為異鼠李素。

化合物13：黃色粉末，易溶于甲醇和二甲亞砜。ESI-MS：m/z：491[M-H]-。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)：12.6(1H，s，OH-5)，8.03(2H，d，brs，H-2’)， 7.44(1H，d，J=9.0 Hz，H-5’)，6.90(1H，d，J=9.0 Hz，H-6’)，6.22(1H，brs，H-8)，6.05(1H，brs，H-6)，5.53(1H，d，J=6.7 Hz，H-1’’)，3.80(3H，s，3’ -OCH3)，3.15-3.82(m)為糖質子信號；13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)：156.8(C-2)，133.5(C-3)，178.0(C-4)，161.7(C-5)，99.2(C-6)，165.2(C-7)，94.3(C-8)，l57.3(C-9)，104.2(C-10)，121.5(C-1’)，114.6(C-2’)，149.9(C-3’)，147.5(C-4’)，115.5(C-5’)，122.6(C-6’)，101.7(C-1’’)，75.4(C-2’’)，76.7(C-3’’)，72.7(C-4’’)，74.6(C-5’’)，172.4(C-6’’)，56.4(3’-OCH3).以上數據與文獻報道[7]的基本一致，故鑒定化合物為異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

3.2 正常HepG2細胞的葡萄糖消耗情況

以空白組為對照，采用正常HepG2細胞對化合物進行降糖活性篩選，葡萄糖氧化酶法檢測各組葡萄糖剩余量，結果如圖1.顯示，化合物3、4、11、12、13組葡萄糖剩余量與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)，葡萄糖含量下降，說明化合物能夠促進細胞消耗葡萄糖。

圖1 不同化合物作用于正常HepG2細胞后其葡萄糖消耗情況Fig.1 Glucose consumption of normal HepG2 cells treated with different compounds

3.3 胰島素耐受HepG2細胞的葡萄糖消耗情況

采用胰島素耐受HepG2細胞對化合物進行降糖活性篩選，葡萄糖氧化酶法檢測各組葡萄糖剩余量，結果如圖2顯示，化合物3、9、11、13組葡萄糖剩余量與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)，葡萄糖含量下降，說明化合物能夠促進胰島素抵抗細胞消耗葡萄糖。

圖2 化合物作用于胰島素耐受HepG2細胞后其葡萄糖消耗情況Fig.2 Glucose consumption of insulin-resistant HepG2 cells treated with different compounds

4 討 論

目前對翻白草的總提取物的藥理學研究較為普遍。胡建新等[10]發現翻白草總黃酮對2型糖尿病大鼠的糖脂代謝及肝組織胰島素底物-2和磷脂酰肌醇-3激酶蛋白表達影響,進一步證實了翻白草黃酮抗糖尿病。李蕊等[11]將總黃酮制成微乳，顯著提高了降糖效果，進一步證實翻白草黃酮類的降糖效果。孫海峰等[12]運用藥理學和數學分析的方法發現翻白草降血糖作用的主要有效成分是翻白草總黃酮。關于翻白草降糖活性的研究目前主要集中在總黃酮類，而關于黃酮單體方面的研究還少有報道。

國外研究學者發現翻白草的提取物可以減輕高血糖和相關代謝的紊亂， 由于在糖尿病個體中，糖異生減少，而糖異生則強烈升高，導致肝臟葡萄糖輸出率增加，最終導致高血糖，翻白草能刺激肝糖原的合成，降低血糖水平[13]。為探討其降糖的機制，我們從提取的化合物的結構分析，由于結構含有槲皮素3-O-β-D-葡糖醛酸的環芳烴有利于逆轉體重減輕[14]；α-葡萄糖苷酶抑制劑被用作抗糖尿病藥物，可以防止碳水化合物產生葡萄糖[15]； 槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸和芹菜素-7-O-葡萄糖苷具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可作為有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑和胰島素增敏劑[16]。從國內外的研究來看，翻白草的提取物對糖尿病具有較好的治療作用，同時對氧化應激有一定的作用，為此我們推測翻白草對糖尿病腎病具有一定的作用。

5 結 論

本課題組目前從翻白草中得到13個黃酮類化合物。采用體外實驗對化合物進行了降糖活性篩選。將從翻白草中提取的化合物以藥物和血清結合的方式作用于正常HepG2細胞與胰島素耐受HepG2細胞，進行降糖活性的篩選。通過篩選，我們發現翻白草的黃酮類化合物具有降糖活性，促進胰島素耐受HepG2細胞消耗葡萄糖的作用。綜上所述，從翻白草中提取的黃酮類化合物具有降糖活性，能夠改善胰島素抵抗，機制可能與PPARγ通路有關。本實驗對翻白草的化學成分進行提取分離、結構鑒定，由于在實驗中植物成分的復雜性以及技術的局限性，并非所有的成分都能被提取分離鑒別，因此，翻白草的化合物對其他疾病的作用有待發掘。