TNFRSF4基因在頭頸鱗癌中的表達及預后價值研究

陳尋 李海同 駱云珍 李群 陳曉紅

[關鍵詞] 頭頸鱗癌;TNFRSF4;分子標志物;診斷;預后

[中圖分類號] R739.9? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）15-0001-04

The expression and prognostic value of TNFRSF4 gene in head and neck squamous cell carcinoma

CHEN Xun1? ?LI Haitong1? ?LUO Yunzhen1? ?LI Qun2? ?CHEN Xiaohong1

1.Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， Jiaxing Second Hospital in Zhejiang Province， Jiaxing? ?314000， China; 2.Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery， Ningbo Medical Center Lihuili Hospital， Ningbo? ?315000， China

[Abstract] Objective To study the correlation between TNF receptor super-family member 4 （TNFRSF4， also known as OX40 gene） and the clinical characteristics of patients with head and neck squamous cell carcinoma and its prognostic value. Methods The public database The Cancer Genome Atlas （TCGA， https：//portal.gdc.cancer.gov/） was used to obtain the expression level of TNFRSF4 in 502 patients with head and neck squamous cell carcinoma， and the prognostic value of the expression level was analyzed. Results This study confirmed that the expression level of TNFRSF4 in head and neck squamous cell carcinoma tissues was significantly higher than that in adjacent tissues， and that the expression of TNFRSF4 was closely related to the lymph node metastasis and T stage of patients with head and neck squamous cell carcinoma， suggesting that TNFRSF4 was involved in the progression of head and neck squamous cell carcinoma. Cox regression model analysis confirmed that the expression of TNFRSF4 could be an independent clinical indicator for prognostic evaluation of head and neck squamous cell carcinoma. The ROC curve showed that the area under the curve （AUC） of TNFRSF4 in the diagnosis of head and neck squamous cell carcinoma was 0.897， and the sensitivity and specificity were 84.1% and 85.0%， respectively. The methylation level of TNFRSF4 promoter region was an important factor affecting its expression level. Conclusion TNFRSF4 gene plays an important role in the occurrence and development of head and neck squamous cell carcinoma. Detection of TNFRSF4 gene may be used as a potential diagnostic marker for head and neck squamous cell carcinoma and is a clinical indicator for judging the good prognosis of head and neck squamous cell carcinoma.

[Key words] Head and neck squamous cell carcinoma; TNFRSF4; Molecular markers; Diagnosis; Prognosis

鱗癌是頭頸腫瘤惡性腫瘤中最常見的病理類型[1]。頭頸部鱗癌根據腫瘤的位置可以分為口腔、口咽、喉和下咽部鱗狀細胞癌。由于頭頸鱗癌早期臨床癥狀不典型，大部分患者發現時已發生淋巴結轉移成為晚期患者。晚期患者的治療手段有限，缺乏有效靶向治療，是遠期生存率較低的主要原因[2]。TNFRSF4屬于腫瘤壞死因子受體（TNF receptor super-family member 4，TNFRSF4）家族主要成員，是免疫共刺激通路的免疫檢查點。TNFRSF4主要在活化CD4+和CD8+細胞中誘導性表達[3]。TNFRSF4與配體結合后能夠促進T細胞克隆性增殖，增強T細胞記憶、增殖、免疫監視和殺傷細胞，阻止免疫耐受的形成[4]。此外，TNFRSF4表達陽性T細胞能夠降低腫瘤免疫微環境中抑制因素，并且能夠有效抑制腫瘤侵襲和轉移的功能[5]。有研究發現在結直腸癌中TNFRSF4表達陽性淋巴細胞水平越高，患者總體生存時間越長[6]。但是TNFRSF4參與頭頸鱗癌發生發展的機制尚未闡明。因此，本文分析TNFRSF4表達在頭頸鱗癌中的表達及預后價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據來源

公共數據庫The Cancer Genome Atlas（TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov/）是美國國家癌癥研究所和美國人類基因組研究所共同監督的一個項目，應用高通量的基因組分析技術幫助人們對癌癥有更好的認識，提高癌癥的預防、診斷和治療能力。本文通過TCGA數據庫下載502例頭頸鱗癌和20例癌旁組織TNFRSF4表達數據、基因甲基化水平及臨床病理信息（包括性別、年齡、生存數據、臨床分期、飲酒史和吸煙史）。頭頸鱗癌患者包括男368例，女134例;平均年齡（61.07±11.89）歲;Ⅰ、Ⅱ期114例，Ⅲ、Ⅳ期374例，14例信息不確切;淋巴結轉移陽性241例，淋巴結轉移陰性242例，19例信息不確切;遠處轉移5例，無遠處轉移483例，14例信息不確切。

1.2 方法

1.2.1 頭頸鱗癌TNFRSF4表達與甲基化的相關性? 為進一步了解TNFRSF4基因中cg位點分布情況，本文首先通過UCSC Genome Browser（https：//genome.ucsc.edu/）共獲取TNFRSF4基因的9個cg位點基因位置（cg09586191，cg23166857，cg23394673，cg14661234，cg22335801，cg12759096，cg01437515，cg20544186和cg09503311）得知，cg09586191和cg23166857位于TNFSF4的啟動子區域內。通過TCGA下載頭頸鱗癌中TNFRSF4基因cg位點甲基化水平的數據。此后利用R軟件中Corrplot包分析頭頸鱗癌中TNFRSF4甲基化與表達之間的相關性。

1.2.2 頭頸鱗癌中TNFRSF4的生存分析? 首先應用單因素Cox回歸模型計算頭頸鱗癌患者的臨床病理特征（性別、年齡、TNM分期、飲酒史、吸煙史和TNFRSF4表達水平）與整體生存相關性;應用多變量Cox回歸分析校準相關臨床病理因素的影響，進一步判斷TNFRSF4表達水平的預后價值。

1.3 統計學方法

應用SPSS 18.0統計學軟件采用獨立樣本t檢驗分析頭頸鱗癌組織與癌旁組織TNFRSF4表達差異和患者臨床病理特征與TNFRSF4表達相關性;采用單因素及多因素Cox回歸模型分析TNFRSF4表達與頭頸鱗癌生存相關性。應用R軟件中Corrplot包分析繪制TNFRSF4各甲基化位點與TNFRSF4表達水平的相關性。

2 結果

2.1 TCGA數據集中頭頸鱗癌和癌旁組織中的TNFRSF4表達水平比較

從TCGA數據庫中下載TNFRSF4表達數據，比較頭頸鱗癌與癌旁組織TNFRSF4表達差異，結果顯示頭頸鱗癌中TNFRSF4表達水平明顯高于癌旁組織[（7.64±1.21） vs. （5.71±0.95），t=-6.98，P<0.001]。

2.2 TNFRSF4表達水平與頭頸鱗癌臨床病理特征的關系

結合公共數據庫中頭頸鱗癌患者的臨床病理特征，我們分析TNFRSF4表達水平與頭頸鱗癌臨床信息的相關性。由表1可見，TNFRSF4表達水平與患者的淋巴結轉移狀態及T分期相關（P<0.05）。而與患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、M分期、腫瘤部位等臨床因素無相關性（P>0.05）。

2.3 單因素Cox回歸模型分析TNFRSF4表達在頭頸鱗癌預后價值

結合頭頸鱗癌生存數據，我們應用單因素Cox回歸模型分析臨床病理因素（飲酒史、吸煙史、TNM分期、性別、年齡和TNFRSF4表達水平）與總生存的相關性。由表2可知，年齡、遠處轉移（M分期）是頭頸鱗癌不良預后因素，而性別（男性）及TNFRSF4高表達水平是頭頸鱗癌預后的保護因素。

2.4 多因素Cox回歸模型分析TNFRSF4表達在頭頸鱗癌預后價值

通過多因素Cox回歸模型分析校準年齡、M分期及性別等因素對頭頸鱗癌預后影響，結果發現TNFRSF4表達及M分期成為頭頸鱗癌患者預后的獨立影響因素。見表3。

2.5 TNFRSF4甲基化水平是影響其表達水平的主要原因

腫瘤細胞中甲基化水平能夠顯著影響基因的表達水平，從而參與腫瘤的發生發展。本研究首先通過UCSC Genome Browser（https：//genome.ucsc.edu/）了解TNFRSF基因的cg位點分布情況。隨后獲取TNFRSF4的甲基化數據，并通過Pearson方法分析TNFRSF4表達水平與甲基化水平相關性。由封三圖1可知，TNFRSF4的2個位于啟動子區域的cg位點的甲基化水平與TNFRSF4的表達水平呈明顯負相關。

2.6 TNFRSF4表達檢測對頭頸鱗癌的診斷價值

通過繪制受試者曲線評估TNFRSF4表達檢測在頭頸鱗癌診斷的應用價值。結果顯示，檢測TNFRSF4表達水平的曲線下面積為0.897，在約登指數（敏感度+特異度-1）最大時，敏感度和特異度分別是84.1%和85.0%，提示TNFRSF4可成為輔助診斷頭頸鱗癌的分子標志物。見圖1。

3 討論

近年來，頭頸鱗癌患者的死亡率居高不下，嚴重威脅人類的健康[7]。深入研究腫瘤發生發展的作用機制是提高喉癌生存率的關鍵因素。頭頸鱗癌的發生與吸煙、飲酒、人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）等多種致病危險因素相關[8]，其共性均能導致機體出現免疫缺陷[9]。大量研究證實，外周T細胞免疫耐受是自身免疫性疾病（包括腫瘤）發生的主要分子機制[10]。免疫耐受發生是由于抗原特異度T細胞功能抑制。研究發現，腫瘤微環境中存在大量功能受損的免疫細胞，也同時存在由腫瘤細胞分泌的免疫抑制細胞因子。這些因子能夠產生局部和全身免疫抑制作用，從而使腫瘤細胞發生免疫逃逸[11-12]。相較于抑制免疫耐受研究進展，目前關于逆轉已建立的免疫耐受研究成果甚少。

TNFRSF4（又稱OX40）和其配體結合后能夠促進T細胞的克隆增生和記憶T細胞的產生和維持[13-15]，增強低反應性T細胞活性[3]，阻止免疫耐受的形成和打破已經建立的免疫耐受[16]。有文獻討論乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤中TNFRSF4表達分布情況[17-18]，在結直腸癌中發現TNFRSF4高表達患者生存時間明顯延長[6]，并且靶向TNFRSF4治療能顯著發揮抗乳腺癌、黑色素瘤等作用[19]。盡管在皮膚鱗狀細胞癌中活化T細胞的數量非常多，皮膚鱗狀細胞癌仍趨于持續生長及發生遠處轉移。為明確這一現象的分子機制，研究者分離皮膚鱗狀細胞癌患者的外周血淋巴細胞，分析發現調節T細胞（Regulatory T cells，Tregs）的水平遠遠高于效應T細胞（CD4+和CD8+T細胞），并且TNFRSF4陽性主要存在腫瘤Tregs上，而通過靶向激活腫瘤Tregs上TNFRSF4能抑制Tregs的免疫抑制效應，增加腫瘤CD4+T細胞增殖發揮抗腫瘤效應[20]。此外作者亦發現發生遠處轉移的皮膚鱗癌患者中TNFRSF4陽性的腫瘤Tregs相較于未發生遠處轉移的更豐富，提示TNFRSF4靶向激動劑更適用于發生遠處轉移的皮膚鱗癌患者[20]。而在頭頸鱗癌中上述現象是否同樣存在。本項研究將探討TNFRSF4表達與頭頸鱗癌各臨床因素相關性，初步探索TNFRSF4表達在頭頸鱗癌的臨床應用價值。

本研究發現，頭頸鱗癌中TNFRSF4表達水平顯著高于癌旁組織中，并且在發生淋巴結轉移頭頸鱗癌患者中TNFRSF4表達水平明顯高于未發生淋巴結轉移的患者，這似乎暗示對于發生淋巴結轉移的頭頸鱗癌，應用TNFRSF4靶向激動劑能更大程度增加腫瘤CD4+T細胞增殖發揮抗腫瘤效應，但這一現象需要更進一步細胞實驗及體內實驗驗證。結合單因素和多因素Cox比例風險模型結果，提示TNFRSF4是頭頸鱗癌良預后的分子標志物。由上述實驗結果，筆者猜想通過靶向激活劑提高腫瘤患者體內TNFRSF4表達水平，從而一定程度阻止免疫耐受的形成和打破已經建立的免疫耐受進而發揮抗腫瘤效應。此外，本研究結果發現啟動子甲基化水平是影響TNFRFSF4表達水平的重要因素。通過抑制頭頸鱗癌患者基因組DNA甲基化水平提高腫瘤患者機體TNFRFSF4表達水平或許能激活機體免疫監管作用，逆轉免疫耐受。

綜上所述，本研究證實了頭頸鱗癌中TNFRSF4表達水平顯著增高，能成為頭頸鱗癌患者預后評估的獨立危險因素，具有成為頭頸鱗癌靶向治療的潛在臨床研究價值。

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（收稿日期：2020-09-01）