miR-3648對胃癌細胞增殖和轉移的影響及其臨床意義*

劉益峰，吳付兵，王 星△，吳佳倫，陳國強

1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院莆田醫療區普外科，福建莆田 351100;2.南京醫科大學附屬逸夫醫院腫瘤科，江蘇南京 210000

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，其發病率高，缺乏有效的治療手段[1]。胃癌通常起源于胃壁，其早期癥狀不明顯，往往被認為是常見的胃疾病，這對早期胃癌的診斷造成影響[2]。盡管近些年來在手術技術和分子靶向治療等方面獲得了不錯的進展，但胃癌患者的總生存率仍不盡如人意[3]。因此，探討胃癌發生、發展過程中的分子調控機制，尋找影響胃癌發生、發展的靶點，對提高胃癌的早期診斷率以及改善預后均有重要意義。大量研究證實微小RNAs(miRNAs)與腫瘤的發生和發展息息相關，被認為發揮了癌基因或抑癌基因的作用[4]。越來越多的人關注了miRNAs在胃癌中的作用，有研究表明miRNAs可能是胃癌診斷和治療監測的潛在生物標志物[5-6]。miR-3648是人類特有的一種miRNA，在類人猿和其他哺乳動物中不存在同源體[7]。有研究表明miR-3648在前列腺癌[8]和膀胱癌[9]中對癌細胞的增殖、侵襲和轉移發揮重要的調控作用。然而，miR-3648在胃癌中的表達和診斷價值，以及在胃癌細胞中的生物學功能有較多未知，本課題組對此進行了研究，旨在為胃癌臨床診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2020年3月在中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院莆田醫療區就診并經病理學確診為原發性胃癌的患者100例，臨床資料見表1。患者在施行胃癌切除術時，收集患者胃癌組織及癌旁正常組織標本。所有參與者無其他腫瘤以及肝腎功能不全，在行胃癌切除術前均未接受免疫治療、放療或化療。記錄患者的臨床病理特征，包括年齡、性別、分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移情況、TNM分期、血清癌胚抗原(CEA)水平、血清糖類抗原(CA)19-9水平、血清CA724水平。檢查結果均經兩位以上的病理醫師或檢驗醫師確認。所有參與研究者均知情同意，并簽署知情同意書。手術切下后的組織標本在做好標記后立即置于液氮中保存，以備用于后續的RNA抽提。

1.2方法

1.2.1OncomiR在線工具分析胃癌中miR-3648的表達 應用microRNA在線工具OncomiR(http://www.oncomir.org)中的TCGA數據庫分析miR-3648在胃癌患者和健康者中表達差異。

1.2.2實時熒光定量反轉錄PCR(qRT-PCR)檢測miR-3648的表達 用Trizol試劑(Invitrogen公司)從組織或細胞中提取總的RNA，采用Mir-XTMmiRNA First-Stand Synthesis Kit(TaKaRa公司)將RNA反轉錄成cDNA。采用ABI 7500定量PCR儀和SYBR premix Ex TaqTMⅡ Kit(TaKaRa公司)進行PCR反應，定量檢測組織或細胞中miR-3648的表達。以U6基因當作內部參照，miR-3648在組織或細胞中的相對表達水平采用2-ΔΔCt方法表示。

1.2.3細胞培養和轉染 采用含有10%胎牛血清(FBS)、1%青-鏈霉素的DMEM培養液(Gibco)培養人胃癌細胞MGC-803和BGC-823以及人胃黏膜正常細胞株GES-1，細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。每隔3天更換1次培養液。取指數生長的細胞用于后續實驗。miR-3648抑制物(inhibitor)和陰性對照(NC inhibitor)序列(廣州銳博生物)轉染MGC-803和BGC-823細胞的步驟和方法參照Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen公司)說明書。細胞分為空白(Blank)組、轉染NC inhibitor的NC inhibitor組和轉染miR-3648 inhibitor的miR-3648 inhibitor組。細胞轉染24 h后，采用qRT-PCR檢測miR-3648的相對表達水平，從而驗證轉染的效率。

1.2.4CCK-8法檢測胃癌細胞增殖 將轉染后的各組細胞按4 000個細胞/孔(加入的細胞懸液為100 μL)接種于96孔細胞培養板中，將細胞置于常規條件中孵育48 h，隨后每孔加 10 μL CCK-8試劑(上海碧云天)并輕輕混勻，37 ℃避光孵育2 h。用酶標讀數儀(Bio-Rad)檢測各孔細胞在450 nm處的吸光度值，計算各組細胞的增殖率。

1.2.5Transwell實驗檢測胃癌細胞遷移和侵襲 細胞遷移實驗：將轉染后各組細胞按每孔4 000個細胞(加入100 μL無血清培養基細胞懸液)接種于Transwell小室上室，小室下室加入800 μL含10% FBS的血清培養基。細胞置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養48 h后，將Tanswell上室取出，小室膜下面的細胞用4%多聚甲醛溶液進行固定，然后用0.1%結晶紫對細胞進行染色，上室內膜表面的細胞用濕棉簽小心擦掉。顯微鏡(Olympus)下對染色細胞進行拍照并計數。檢測細胞侵襲時，預先鋪上一層Matrige基質膠(BD)在Transwell小室的內部膜上，其余同細胞遷移實驗。Matrigel基質膠配制和處理參考說明書進行。

2 結 果

2.1miR-3648在胃癌中的表達分析 在線工具OncomiR分析顯示：與健康人群(中位數為0.04)比較，胃癌患者的miR-3648相對表達水平(中位數為0.54)顯著升高(P<0.05)。qRT-PCR檢測收集的100例胃癌組織和癌旁組織標本顯示：miR-3648在胃癌組織中的相對表達水平[4.94(2.68～7.15)]顯著高于癌旁正常組織中的相對表達水平[1.66(1.09～2.31)]，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2miR-3648的相對表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關系 不同年齡、性別和分化程度的胃癌患者間，胃癌組織中miR-3648的相對表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；但不同腫瘤最大徑、淋巴結轉移情況、TNM分期、CEA水平、CA19-9水平和CA724水平的胃癌患者間miR-3648的相對表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 miR-3648表達和胃癌患者臨床病理特征的關系[ n=100,M(P25～P75)]

續表1 miR-3648表達和胃癌患者臨床病理特征的關系[ n=100,M(P25～P75)]

2.3miR-3648相對表達水平對胃癌的診斷價值 以胃組織中miR-3648相對表達水平作為檢測指標，繪制診斷胃癌的ROC曲線,見圖1。曲線下面積為0.897(95%CI：0.853～0.940)。胃組織中miR-3648的相對表達水平診斷胃癌的最佳截斷值為3.02，此時的靈敏度為70.0%，特異度為100.0%。

圖1 ROC曲線分析miR-3648對胃癌的診斷價值

2.4miR-3648在胃癌細胞中表達 與GES-1細胞(1.000±0.035)比較，MGC-803和BGC-823細胞中的miR-3648相對表達水平(分別為3.300±0.146、4.430±0.163)均顯著升高(t=26.50、35.65，P<0.05)。

2.5轉染miR-3648 inhibitor對胃癌細胞中miR-3648表達的影響 MGC-803和BGC-823細胞轉染24 h后，qRT-PCR檢測顯示：Blank組、NC inhibitor組和miR-3648 inhibitor組之間miR-3648相對表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。與轉染NC inhibitor比較，轉染miR-3648 inhibitor后MGC-803和BGC-823細胞中miR-3648的相對表達水平均顯著下調(P<0.05)，見表2。

表2 轉染miR-3648 inhibitor對胃癌細胞miR-3648相對表達水平的影響

2.6抑制miR-3648表達對胃癌細胞增殖的影響 MGC-803和BGC-823細胞經轉染24 h后，CCK-8法檢測顯示：Blank組、NC inhibitor組和miR-3648 inhibitor組之間增殖率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。與轉染NC inhibitor后的細胞增殖率比較，轉染miR-3648 inhibitor后胃癌MGC-803和BGC-823細胞增殖率顯著降低(均P<0.05)，細胞生長明顯受到抑制，見表3。

表3 轉染miR-3648 inhibitor對胃癌細胞增殖率的影響

2.7抑制miR-3648表達對胃癌細胞遷移和侵襲的影響 MGC-803和BGC-823細胞經轉染24 h后，Transwell實驗顯示：Blank組、NC inhibitor組和miR-3648 inhibitor組間遷移細胞數和侵襲細胞數比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2、表4。與轉染NC inhibitor的細胞比較，轉染miR-3648 inhibitor的MGC-803和BGC-823細胞每視野的遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著減少(P<0.05)，見表4。

圖2 miR-3648抑制對胃癌細胞遷移和侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

表4 miR-3648抑制對胃癌細胞遷移和侵襲的影響個/視野)

3 討 論

胃癌是一種多因素疾病，幽門螺桿菌感染、遺傳以及飲酒、吸煙等均可能導致胃癌的發生[10-11]。有研究證實miRNAs在細胞生長、分化、轉移等過程中扮演著重要的角色[12]。異常表達的miRNAs影響腫瘤的增殖和侵襲[13]。因此，識別參與腫瘤發生和轉移的特異性miRNAs可以為腫瘤的診斷和治療提供線索。miR-3648在多種腫瘤中異常表達并發揮重要的調控作用。如SUN等[9]研究發現miR-3648在人膀胱癌組織中的表達水平明顯高于癌旁非腫瘤組織。XING等[8]研究發現miR-3648在前列腺癌組織中高表達。本研究發現，miR-3648在胃癌組織和胃癌細胞中的表達水平顯著上調，提示miR-3648在胃癌中可能發揮了癌基因的功能。本研究隨后發現胃癌患者的癌組織標本中miR-3648的相對表達水平與腫瘤最大徑、淋巴結轉移、TNM分期、CEA水平、CA19-9水平和CA724水平有關，表明miR-3648的異常表達與胃癌的發展以及胃癌現有的標志物水平有關。此外，當胃組織中miR-3648的相對表達水平為3.02時，其診斷的靈敏度為70.0%，特異度為100.0%，提示miR-3648的相對表達水平對胃癌診斷具有一定的價值。

異常表達的miR-3648在細胞增殖和轉移中發揮重要的調控作用。RASHID等[14]研究發現過表達miR-3648能下調抑癌基因APC2表達從而促進細胞增殖。MIN等[15]研究發現miR-3648的過表達對骨髓間充質干細胞的成骨分化起促進作用。在人膀胱癌中，抑制miR-3648的表達能夠抑制癌細胞的遷移和侵襲[9]。過表達miR-3648促進前列腺癌細胞增殖[8]。本研究表明抑制miR-3648表達能夠顯著抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，這與其在膀胱癌和前列腺癌中的作用相似，證實了miR-3648在胃癌細胞中發揮癌基因的作用。

然而，本研究具有一定局限性。首先，miR-3648在胃癌中調控的靶基因仍需進一步探討；其次，miR-3648在體內對腫瘤增殖和轉移的影響還不清楚；最后，胃組織中miR-3648的相對表達水平用于胃癌診斷的靈敏度為70.0%，特異度為100.0%，靈敏度較低，因此需要進一步研究miR-3648在胃癌患者血液中的表達以及其在胃癌中的診斷價值，或聯合現有胃癌標志物構建聯合診斷模型來提高診斷靈敏度。

綜上所述，當胃組織中miR-3648相對表達水平為3.02時，其診斷的靈敏度為70.0%，特異度為100.0%。抑制miR-3648表達能夠抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，因此miR-3648有望成為胃癌診斷和治療監測的分子標志物。