TRIF在血栓閉塞性脈管炎患者血管組織中的表達水平及臨床意義*

尹江燕，郭 軼

1.重慶醫科大學附屬第一醫院超聲科，重慶 400016；2.重慶大學附屬中心醫院/重慶市急救醫療中心普外科，重慶 400014

血栓閉塞性脈管炎(TAO)是一種病因尚不明確的主要累及中、小型動靜脈的節段性、炎癥性和閉塞性疾病[1]。近期許多研究發現，過度自身免疫反應誘發靶器官炎癥進而導致的血管痙攣、炎性閉塞和血栓形成與TAO的起病及進展密切相關[2-4]。β干擾素Toll樣受體結構域銜接蛋白(TRIF)信號通路是Toll樣受體家族重要的下游通路，其被證實與多種自身免疫性疾病密切相關[5-6]，本課題組前期研究發現TRIF在TAO患者的腰交感神經節中有高表達，其通過誘發神經節炎癥間接地導致血管痙攣，可能參與TAO的發病過程[7]。但在TAO患者受損最嚴重的靶器官外周血管組織中TRIF的表達情況及其意義卻少見報道，因此本課題組對TAO患者血管組織中TRIF的表達水平進行了檢測，并分析了其在血管組織中的表達特點，旨在進一步闡明TRIF信號通路與TAO發病的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2019年12月重慶醫科大學附屬第一醫院和重慶市急救醫療中心臨床診斷為TAO并行下肢截肢的患者(在術后病理診斷確診為TAO，排除術后病理無法確診及確診為其他疾病的患者)作為TAO組，共納入26例，其中男26例、女0例，年齡36～52歲(中位年齡42.2歲)。選取同期重慶醫科大學附屬第一醫院和重慶市急救醫療中心無血管相關疾病病史因其他疾病行下肢截肢的患者(術后病理檢查均排除血管相關疾病)作為對照組，共納入18例，其中男11例、女7例，年齡26～55歲(中位年齡44.5歲)。

1.2儀器與試劑 TRIF、CD31、SAM抗體購自Sigma公司，生物素化二抗(博士德，武漢)，辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(中杉，北京)，RNA提取和擴增試劑盒(TaKaRa)，蛋白質裂解試劑盒，BCA蛋白濃度試劑盒，配膠試劑盒，ECL顯影試劑盒(碧云天，江蘇)，熒光采集處理與分析系統(Leicaqwin，德國)。

1.3反轉錄PCR(RT-PCR)檢測 取上述納入研究者血管組織標本(均為下肢)，先用Trizol法進行總RNA的提取，每50～100 mg組織標本碾碎后加入1 mL Trizol試劑行組織裂解，取裂解液加入0.2 mL氯仿，振蕩后室溫放置5 min，4 ℃離心10 min(12 000 r/min)， 轉移水相后加入異丙醇再次離心，棄上清液后加入預冷的75%乙醇洗滌、離心并檢測RNA濃度。然后按照PCR試劑盒說明書進行RNA的反轉錄和目的基因擴增。PCR擴增引物(由上海英駿生物有限公司合成)，TRIF上游引物：5′-AAACCAGCACCAACTACCCA-3′；下游引物：5′-CTTCCAAACTTCACGCTCT-3′；擴增片段為293 bp。GAPDH上游引物：5′-AGTCCACTGGCGTCTTCA-3′；下游引物：5′-AGTCCTTCCACGATACCAA-3′；擴增片段為232 bp。擴增條件為94 ℃預變性2 min；隨后94 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。最后運用Gene凝膠圖像儀進行圖像采集、分析、測量、統計分析。

1.4Western blot檢測 取少許新鮮血管組織放入預先加入1 mL蛋白提取緩沖液和蛋白酶抑制劑的勻漿器中，冰上研磨后吸取研磨液，冰上孵育10 min，4 ℃離心10 min(12 000 r/min)。吸取上清液用BCA蛋白質定量試劑盒測量蛋白濃度后分裝。按照1∶5的比例加入上樣緩沖液后置于100 ℃沸水中3 min進行蛋白變性。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中，每孔上樣量30 μL，60 V、30 min，再用100 V、1 h，PVDF膜100 mA轉膜1 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入按1∶1 000稀釋的TRIF一抗，4 ℃孵育過夜。加入二抗，37 ℃孵育2 h，TBST清洗后用ECL發光試劑盒進行曝光。選用GAPDH為內參對照。用ECL發光試劑盒進行檢測，Image Lab凝膠成像分析軟件進行圖像掃描與分析。

1.5免疫熒光共聚焦檢測 取冰凍臨床手術標本組織，用4%多聚甲醛緩沖液固定24 h后，用15%和30%蔗糖梯度脫水，沉底后進行切片。加入5%山羊血清37 ℃，20 min。去血清后加入一抗TRIF抗體(1∶100)，并分別加入CD31和SAM抗體(1∶250)，4 ℃過夜。次日加入二抗，37 ℃，50 min，加入DAPI，37 ℃，6 min。封片后在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察和采圖。

2 結 果

2.1TRIF mRNA和蛋白在TAO組和對照組患者血管組織中表達 RT-PCR結果顯示，TRIF和內參GAPDH的PCR擴增片段分別為293、232 bp；TAO組TRIF mRNA的吸光度值為0.831±0.033，明顯高于對照組TRIF mRNA的吸光度值(0.192±0.008)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。同時Western blot結果顯示，TRIF和內參GAPDH的蛋白相對分子質量大小分別為66×103、37×103；TAO組TRIF蛋白的吸光度值為0.806±0.015，明顯高于對照組TRIF蛋白的吸光度值(0.162±0.017)，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 TRIF mRNA RT-PCR檢測的電泳圖

圖2 TRIF蛋白表達水平檢測的Western blot圖

2.2TRIF在TAO患者血管組織細胞中的表達特點 免疫熒光組織染色顯示，在TAO患者血管組織中在可以見到TRIF的高表達，以SAM染色代表平滑肌，可觀察到兩者共表達，見圖3。TAO患者血管中膜的平滑肌細胞可以分泌TRIF蛋白，并且TRIF主要在細胞質和細胞膜上表達。

注：a表示細胞核染色；b為血管組織中TRIF的表達；c為平滑肌的SAM染色；d表示SAM和TRIF的共表達情況。

3 討 論

TAO又稱Buerger′s病，于1908年被首次報道。雖經過了一個多世紀的探索和研究，TAO的發病機制仍未闡明，其治療效果亟待提高，截肢仍是絕大多數TAO患者的最終結局[3,8]。近期許多研究發現TAO的起病與煙草、細菌感染及寒冷刺激誘發的自身免疫性炎癥密切相關[9]；TAO患者的病理生理改變主要為血管痙攣、血管組織炎性損傷及繼發血栓形成，但其具體機制尚不明確[4,10]。因此，自身免疫性炎癥損傷與TAO發病的相關性逐漸成為TAO的研究熱點之一。自身免疫性炎癥是復雜的分子生物過程，多種免疫相關信號通路參與其中[11]，Toll樣受體(TLRs)通路是機體最重要的非特異性固有免疫應答途徑，其可通過激活一系列下游信號通路進而調節機體免疫應答和自身免疫性炎性反應[12]；近期許多研究也發現TLRs通路與多種自身免疫性疾病密切相關[13]。TRIF信號通路是TLRs最重要的下游通路之一，其主要與TLR4結合參與多種炎性疾病及自身免疫性疾病的發病過程[14]，但TRIF通路與TAO的相關性的相關研究仍較少。本試驗檢測TRIF在TAO患者血管組織中的表達情況，初步探討TRIF通路與TAO發病的相關性。

在TAO的發病及進展過程中，血管痙攣是最早和最主要的臨床表現之一，而且血管痙攣貫穿TAO的整個病程[15]。絕大多數TAO患者起病初期以血管痙攣為主要表現，血管痙攣與交感神經功能紊亂密切相關，因此，早期的TAO患者行腰交感神經切除術或用藥物阻斷缺血患肢的周圍交感神經可明顯改善下肢血管痙攣進而減輕缺血癥狀[15-16]，但誘發及促進TAO患者血管痙攣的機制尚未明確。有研究發現，TAO患者血管外膜神經分布異常和兒茶酚胺的缺乏可能是導致其血管痙攣的重要因素[17]。支配四肢小血管舒縮功能的神經纖維來自交感神經節，主要是交感縮血管神經纖維，若神經節發生病變，可導致神經遞質釋放異常，進而引發神經炎癥性血管痙攣[18]，但其具體機制有待進一步闡明。本課題組前期研究發現TRIF在TAO患者腰交感神經節中高表達，該通路可能參與神經功能異常誘發TAO患者血管痙攣的發病過程[7]。

但隨著TAO的進展，血管痙攣會進行性加重，而且行腰交感神經切除術或用藥物阻斷患肢的周圍交感神經無法緩解血管痙攣。這種現象提示隨著TAO的進展，血管痙攣可能存在多因素的聯合作用。血管平滑肌在血管的收縮中也起重要作用，血管痙攣和血管平滑肌的功能也存在密切相關[19]。研究發現，血管平滑肌的炎癥或者功能異常均可導致血管痙攣[20]；同時有研究發現TRL4信號通路可以參與腦血管痙攣的病理生理過程，其作用機制可能與TRL4通過TRIF通路激活下游的NF-κB通路進而誘發的平滑肌炎癥有關[21]。因此，結合本課題組前期研究，筆者推測TRIF通路也可能通過誘發TAO患者血管壁平滑肌的炎性反應進而加重血管痙攣的發生。本研究通過檢測TAO患者血管組織標本中TRIF的mRNA、蛋白發現其TAO患者血管組織中的表達遠高于對照組。同時熒光共聚焦顯示TRIF主要在TAO患者血管肌層的平滑肌細胞的細胞質和細胞膜表達，在血管內膜的內皮細胞未見明顯表達。這些結果證實TRIF通路可能也可以誘發血管平滑肌的炎癥進而加重TAO患者的血管痙攣，導致疾病的進展。其具體機制可能是TRIF通路激活其下游的NF-κB通路進而活化一系列炎性反應。首先NF-κB通路可以誘導激活物蛋白1(AP-1)直接導致平滑肌細胞的損傷，導致平滑肌細胞失去彈性并保持僵硬狀態誘發持續性血管痙攣[22]；同時，NF-κB通路還可以誘導白細胞分泌大量炎性介質如白細胞介素(IL)家族(IL-1、IL-2、IL-8等)，這些炎性介質可以誘發平滑肌炎性反應，引起平滑肌細胞收縮進而導致血管痙攣[23]；最后，NF-κB通路還可以促進血管內皮細胞分泌內皮細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞間黏附分子-1(VCAM-1)等炎性介質進而誘發血管壁平滑肌細胞間的炎性黏附導致血管痙攣[24]。但是各種炎性介質誘發的炎性反應導致平滑肌細胞強烈收縮的機制仍需進一步研究。

綜上所述，TRIF在TAO患者血管組織的高表達與TAO的發病和進展密切相關。其可能的機制是TRIF激活下游的NF-κB通路誘發血管平滑肌細胞發生一系列嚴重的炎性反應，進而引導持續性的血管痙攣導致TAO的發病及進展，但是其具體的作用機制仍有待進一步的研究。同時針對TRIF的靶向治療可能成為TAO治療的新方法。