以藥代動力學檢測指標探討血必凈注射液聯合左氧氟沙星治療急性胰腺炎的增效作用機制*

楊巧虹，姚高瓊，周遠大，賈春燕，楊 輝△

1.重慶醫療器械質量檢驗中心，重慶 401147；2.重慶醫科大學附屬第一醫院藥學部，重慶 400016；3.重慶醫科大學藥學院，重慶 400016

急性胰腺炎(AP)是臨床常見疾病，重癥急性胰腺炎(SAP)往往伴有胰腺的出血壞死，常繼發感染、腹膜炎和休克等，病死率為40%～70%。80%的SAP死亡病例的死因與胰腺感染有關[1-4]。目前臨床SAP的治療措施主要包括應用抗感染藥物、糾正水電解質紊亂、支持治療、抑制胰腺分泌、防止局部及全身并發癥等。一些研究表明，中藥血必凈注射液聯合抗菌藥物使用可起到良好的協同作用，臨床效果明顯優于單用抗菌藥物[5-9]。目前的研究認為，其機制是血必凈注射液可以起到中和內毒素、快速控制炎癥的雙重效應，具有明顯的抗炎效果[9]。但迄今為止，筆者未見從藥代動力學角度探討血必凈注射液對抗菌藥物在胰腺組織中分布影響的相關文獻報道。為此，本研究探討了血必凈注射液對抗菌藥物在小鼠胰腺組織中分布的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康合格的SPF級KM小鼠108只，體質量(20±2)g，雌雄各半，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。小鼠飼養室溫度保持20～25 ℃，相對濕度50%～65%。在封閉環境中采用光照定時裝置，提供適當晝夜光變化周期(光照14 h、黑暗10 h)。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 Shimadu SPD-20A型高效液相色譜(HPLC)儀(日本島津公司，含雙泵、梯度洗脫、可調波長紫外檢測器，自動進樣系統和Labsolutions工作站)；BP610型電子天平(德國Sartorius公司，最低檢出限：0.1 mg)；Aliegra64R型冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)；MX-S型可調式混勻儀[大龍興創實驗儀器(北京)有限公司]；組織勻漿機(江蘇其林醫用儀器廠)。

1.2.2試劑 血必凈注射液(規格：10毫升/支，天津紅日藥業股份有限公司);左氧氟沙星(純度：80.6%，上虞京新藥業有限公司)，用時配制成質量濃度為13.2 mg/mL的無菌氯化鈉溶液；環丙沙星(純度：84.2%，中國食品藥品檢定研究院)；左氧氟沙星標準對照品(純度：97.3%，中國藥品生物制品檢定所)；0.9%氯化鈉注射液(規格：500毫升/瓶，西南藥業有限公司)；二氯甲烷(分析純，每瓶500 mL，重慶川東化工集團有限公司)；甲醇[色譜純，霍尼韋爾貿易(上海)有限公司]。

1.3方法

1.3.1HPLC法的色譜條件 色譜柱：InertSustain C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；預柱：Agilent C18保護柱(4.0 mm×3.0 mm，5 μm)；流動相：0.02 mol/L甲醇(A)-0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(B，30∶70，V/V，pH=3.15)；流速：1 mL/min；檢測波長：290 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；內標：環丙沙星(使用前配制成質量濃度33.6 μg/mL)。

1.3.2動物分組及給藥 小鼠適應性飼養1周，實驗前禁食不禁水12 h。將108只小鼠按隨機數字表法分為兩組，每組54只，雌雄各半，對照組給予0.9%氯化鈉注射液聯合左氧氟沙星，實驗組給予血必凈注射液聯合左氧氟沙星。兩組小鼠均連續3 d給藥，每天1次，分別腹腔注射血必凈注射液22 mL/kg或等體積0.9%氯化鈉注射液。末次腹腔注射后1 h，各組小鼠均靜脈注射左氧氟沙星132 mg/kg。

1.3.3標本采集 末次腹腔注射后1 h，各組小鼠均靜脈注射左氧氟沙星132 mg/kg后，按時間點3、5、10、30、60、120、240、 480和720 min，將對照組和實驗組小鼠分為9組，每組6只，分別于各時間點對6只小鼠采集血液和胰腺組織。血液經肝素抗凝，離心取血漿；胰腺組織稱質量，按10%的質量百分比制為胰腺組織勻漿。均置于-20 ℃冰箱保存待測。

1.3.4標本處理 (1)血漿標本：取小鼠血漿100 μL，加入33.6 μg/mL的內標環丙沙星溶液40 μL，再加入800 μL二氯甲烷，渦旋振蕩提取10 min，15 000 r/min (半徑9.5 cm)離心10 min，靜置分層，吸取下層有機相600 μL備用。剩余溶液中再加入800 μL二氯甲烷，渦旋振蕩提取10 min，15 000 r/min(半徑9.5 cm)離心10 min，吸取下層有機相600 μL。將兩次的提取液合并，氮氣吹干，200 μL甲醇復溶，15 000 r/min(半徑9.5 cm)離心10 min，取上清液10 μL備用。(2)胰腺組織勻漿標本：取小鼠胰腺組織勻漿200 μL，加入33.6 μg/mL的內標環丙沙星40 μL，再加入1.5 mL二氯甲烷，渦旋振蕩提取10 min，15 000 r/min(半徑9.5 cm)離心10 min，靜置分層，吸取下層有機相1 mL備用。剩余溶液中再加入1.5 mL二氯甲烷，渦旋振蕩提取10 min，15 000 r/min(半徑9.5 cm)離心10 min，吸取下層有機相1 mL。將兩次的提取液合并，氮氣吹干，200 μL甲醇復溶，15 000 r/min(半徑9.5 cm)離心10 min，取上清液10 μL備用。因為本研究的給藥方法為靜脈注射給藥，靜脈給藥無吸收過程，給藥后初始的幾個時間點血藥濃度高，但120 min后血藥濃度下降很快，故在實際操作中，給藥后120 min內的血漿標本和胰腺組織勻漿標本均作了稀釋20倍處理。

1.3.5方法學考察 (1)專屬性考察。按1.3.1項下色譜條件和1.3.4項下標本處理方法處理，檢測空白血漿、空白血漿+3.0 μg/mL左氧氟沙星對照品+2.0 μg/mL環丙沙星(內標)、給藥6 h所取血漿標本，以及空白胰腺組織勻漿、空白胰腺組織勻漿加1.5 μg/mL的左氧氟沙星對照品和1.0 μg/mL的內標環丙沙星、給藥6 h所取胰腺組織勻漿標本。(2)標準曲線、線性關系、最低定量質量濃度。在空白血漿和空白胰腺組織勻漿中分別添加左氧氟沙星，使其質量濃度相當于0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、20.00 μg/mL(血漿)，0.02、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、12.00 μg/mL(胰腺組織勻漿)，按1.3.4項下方法處理標本并測定。(3)檢測限與定量限。在空白血漿和空白胰腺組織勻漿中分別添加左氧氟沙星，使其質量濃度約為0.05 μg/mL和0.02 μg/mL，按1.3.4項下方法處理標本并測定，記錄峰面積，以信噪比為3∶1和10∶1分別計算二者的檢測限和定量限。(4)精密度與提取回收率。用空白標本配制成高、中、低3個質量濃度的標本(血漿：1.0、4.0、16.0 μg/mL，胰腺組織勻漿：0.5、4.0、8.0 μg/mL)，每個質量濃度下標本各3份，按1.3.4項下方法處理標本并測定日內精密度(每個質量濃度1 d內測3次)和日間精密度(每個質量濃度連續測3 d，每天測1次)，按測定量與加入量之比計算提取回收率。(5)穩定性考察。標本溶液濃度與(4)項下相同。凍融穩定性考察:反復冷凍(-20 ℃)、融化(60 ℃內)3次；溫度因素考察：標本在4 ℃、室溫下保存24 h；時間因素考察：室溫放置2、10 h后再按1.3.4項下方法操作。

1.3.6小鼠靜脈注射左氧氟沙星后血漿和胰腺組織藥物濃度檢測 按132 mg/kg靜脈注射左氧氟沙星后，取實驗組和對照組小鼠血漿及胰腺組織勻漿，按1.3.4項下方法操作并測定、記錄峰面積之比。將左氧氟沙星與內標環丙沙星峰面積之比代入標準曲線方程，求得血漿中左氧氟沙星的質量濃度，同時按所稱取胰腺的質量換算出胰腺組織中左氧氟沙星的質量濃度，分別繪制左氧氟沙星的藥物質量濃度-時間曲線(簡稱為藥-時曲線)。

2 結 果

2.1方法學考察

2.1.1專屬性考察 HPLC圖見圖1。在本研究擬訂的色譜條件下，血漿、胰腺組織中左氧氟沙星的保留時間均約為5.5 min，內標環丙沙星的保留時間約為7.5 min，二者峰形良好，不受血漿和胰腺組織中內源性物質以及血必凈注射液的各成分干擾，藥物及內標達到基線分離，分離度良好(R>2.7)，表明該方法專屬性好。

2.1.2標準曲線、線性關系、最低定量質量濃度 所得數據經回歸分析，得血漿、胰腺組織的標準曲線方程分別為Y1=0.004 4+0.237 8×8X(r=0.998 9，n=9)和Y2=0.006 8+0.245 4X(r=0.991 9，n=9)，其回歸方程在所測質量濃度范圍內線性關系良好。左氧氟沙星最低定量質量濃度分別為0.050 μg/mL(n=3)和0.020 μg/mL(n=3)，相對標準偏差(RSD)均小于10%，符合生物標本的測定要求。

2.1.3檢測限與定量限 血漿和胰腺組織中左氧氟沙星的檢測限分別為0.05 μg/mL和0.02 μg/mL，定量限分別為0.050 μg/mL和0.080 μg/mL。

2.1.4精密度與提取回收率 結果見表1。

表1 血漿、胰腺組織勻漿標本檢測的日內、日間精密度和提取回收率(%，n=5)

2.1.5穩定性考察 結果見表2。

表2 血漿、胰腺組織勻漿的穩定性考察結果(n=5)

注：A為空白血漿；B為空白血漿+左氧氟沙星對照品+內標；C為給藥6 h所取血漿標本；D為空白胰腺組織勻漿；E為空白胰腺組織勻漿+左氧氟沙星對照品+內標；F為給藥6 h所取胰腺組織勻漿標本。

2.2小鼠靜脈注射左氧氟沙星后血漿和胰腺組織藥物濃度 結果見表3、圖2。實驗組與對照組小鼠血漿中左氧氟沙星的藥-時曲線相似，實驗組血液中左氧氟沙星質量濃度有升高趨勢，但給藥后4 h內(不含4 h)兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。實驗組與對照組小鼠胰腺組織中左氧氟沙星的質量濃度變化與血漿同步，在給藥后4 h內各點，胰腺組織中左氧氟沙星質量濃度明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 小鼠靜脈注射左氧氟沙星后的血漿和胰腺組織中藥物濃度

續表3 小鼠靜脈注射左氧氟沙星后的血漿和胰腺組織中藥物濃度

2.3藥代動力學參數 實驗組小鼠血漿藥代動力學參數Vd低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明實驗組左氧氟沙星廣泛分布于組織中，血漿濃度較低。實驗組AUC0-12明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明血必凈注射液可顯著提高胰腺組織中左氧氟沙星質量濃度。見表4。

注：A為血漿標本的檢測；B為胰腺組織勻漿標本的檢測。

表4 小鼠靜脈注射左氧氟沙星后的藥代動力學參數

3 討 論

檢測左氧氟沙星在血漿和組織中的藥物質量濃度可采用HPLC-熒光法、HPLC-紫外線(UV)法或液相色譜質譜聯用(LC-MS)法[10-13]。本研究中參照孔令希等[14]采用的HPLC-UV法檢測左氧氟沙星，該方法為本課題組多年測定血漿和組織中左氧氟沙星質量濃度所用。本研究中運用高效液相色譜儀，以環丙沙星作內標，將色譜圖于8 min內展現出來，檢測結果穩定可靠，相同波長下各種物質的出峰互不干擾，分析時間短，分離度好，可節省人力、物力，有利于研究機構高效地檢測送檢標本。

根據對細菌的殺菌活性，抗菌藥物可分為兩類，即時間依賴性抗菌藥物和濃度依賴性抗菌藥物。抗菌藥物作用的時間依賴性是指抗菌藥物的殺菌活性與其跟細菌接觸的持續時間呈正比，即藥物的抗菌療效取決于藥物在組織中濃度維持在最小抑菌濃度(MIC)以上的持續時間，而藥物濃度超過細菌MIC 4～5倍以上時殺菌活力不再增加。時間依賴性抗菌藥物有β-內酰胺類、部分大環內酯類、酰胺醇類等，其評價指標為藥物濃度高于MIC的時間(T>MIC)和t1/2α、t1/2β。抗菌藥物作用的濃度依賴性或稱劑量依賴性是指抗菌藥物的殺菌活性與其藥物濃度(或給藥劑量)呈正比，即藥物的抗菌療效取決于其在組織中分布的濃度。濃度依賴性抗菌藥物有氨基糖苷類、氟喹諾酮類及硝基咪唑類等，其評價指標為藥-時曲線下面積與最小抑菌濃度之比(AUIC)和血藥峰濃度與最小抑菌濃度之比(Cmax/MIC)。

左氧氟沙星治療嚴重感染時的療效與AUIC有密切關系，每日給藥次數不宜過多。本研究結果顯示，胰腺組織中左氧氟沙星AUC0-12實驗組為(223.68±25.96)μg·h/mL，而對照組為(171.42±30.00)μg·h/mL，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，表明血必凈注射液顯著提高了胰腺組織中左氧氟沙星的質量濃度，對左氧氟沙星發揮抗菌作用可產生很大的增強效果。此外，血漿中左氧氟沙星Vd：實驗組為(0.07±0.01)L/kg，對照組為(0.08±0.01)L/kg，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)；胰腺組織中左氧氟沙星Vd：實驗組為(0.13±0.04)L/kg，而對照組為(0.08±0.02)L/kg，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。這說明實驗組的左氧氟沙星廣泛分布于組織中可能導致血漿質量濃度較低，而對照組的左氧氟沙星在組織中質量濃度低于實驗組、血漿質量濃度高于實驗組，表明血必凈注射液還可能通過改變左氧氟沙星的組織分布來提高抗菌效果。以上藥代動力學參數計算結果表明，血必凈注射液同左氧氟沙星聯合使用可產生明顯的協同效應，與其改變藥物的分布應該有一定關系。

李青等[15]報道，在68例SAP患者中，大腸埃希菌是SAP患者腹腔中最主要的致病菌。分離菌株前3位分別為大腸埃希菌(30.77%)、銅綠假單胞菌(14.53%)、肺炎克雷伯桿菌(12.82%)。蔣玉富等[16]報道，臨床分離的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌對左氧氟沙星的MIC50分別為0.03、1.00、0.03 μg/mL，MIC90分別為16、16、16 μg/mL。本研究顯示，胰腺組織中左氧氟沙星質量濃度，對照組在給藥后3 min為(221.20±15.12)μg/mL，120 min為(16.89±1.46)μg/mL；實驗組在給藥后3 min為(245.69±17.16)μg/mL，120 min為(22.36±4.98)μg/mL。可見，給藥后120 min實驗組胰腺組織中左氧氟沙星平均質量濃度較菌株體外給藥的MIC50和MIC90高出1.40～745.33倍，且實驗組胰腺組織平均藥物質量濃度為對照組的1.32倍。

本研究顯示，血必凈注射液可以明顯提高左氧氟沙星在胰腺組織中的藥物質量濃度。其原因可能與血必凈注射液組分紅花、丹參、赤芍、川芎、當歸等均具有活血化瘀、扶正祛邪、通經活絡、行氣活血有關。現代藥理研究表明，紅花可擴張血管，改善微循環，可能是直接或部分通過阻斷α-受體而促進血流加快、毛細血管網開放數量增加、血細胞聚集減輕，從而防止血栓形成和發展，以及抗組織缺氧所致損傷；丹參中丹參酮ⅡA磺酸鈉可擴張側支血管，改善微循環，促使毛細血管網開放數量增加；赤芍可抗血栓形成，抑制血小板聚集，可降低血液黏度，改善血液流變學參數，同時可緩解血管平滑肌痙攣而促進血液流動；川芎中川芎嗪可通過興奮β-受體而擴張血管，興奮心臟而增加血流量，對抗去甲腎上腺素所致血管緊張，降低血管阻力，降低全血黏度，穩定紅細胞的變形能力，抑制血栓形成；當歸可延長小鼠血漿凝血酶時間和凝血活酶時間，改變血液流變學和降低血液黏度，抗血小板聚集，且對外周血管有明顯擴張作用而使外周血流量增加，還可拮抗去甲腎上腺素所致的血管痙攣和血流量減少[17-18]。

綜上所述，血必凈注射液同左氧氟沙星聯合使用，前者可通過使炎癥組織血管擴張、微循環改善、血流動力學改變而讓后者易于進入胰腺組織中，使脂溶性較高的左氧氟沙星更易同胰腺組織的細胞脂質結合，從而提高組織中藥物濃度，增強抗菌作用，使二者產生協同作用。