微小RNA-1265在鼻咽癌中的表達及診斷價值*

張余良,鄧國慶，劉術舟，周安燕

海南省人民醫(yī)院/海南醫(yī)學院附屬海南醫(yī)院:1.耳鼻咽喉頭頸外科;2.呼吸與危重癥醫(yī)學科，海南海口 570311

鼻咽癌是我國南方發(fā)病率極高的惡性腫瘤[1]，癌基因和抑癌基因平衡紊亂是鼻咽癌發(fā)病的重要因素。在鼻咽癌高發(fā)地區(qū)，約70%的鼻咽癌患者確診時已經處于晚期。盡管鼻咽癌的診斷和治療已經取得了較大進展，但約30%的高危患者存在復發(fā)的風險[2]。由于鼻咽癌的解剖位置較隱蔽且腫瘤細胞對射線較敏感，放療仍是鼻咽癌的首選治療方式。鼻咽癌5年生存率為87%～96%[3]。進一步探討鼻咽癌的發(fā)病機制對提高鼻咽癌治療效果具有重要的意義。微小RNA(miRNA)為一類小分子RNA，可與靶基因mRNA結合，調控基因表達[4-5]。鼻咽癌進展過程中存在多種miRNA的異常表達[6-7]。miR-1265是新近發(fā)現(xiàn)的小RNA分子,其在胃癌[8]、結直腸癌[9]及肺腺癌[10]中表達上調，同時血漿miR-1265可能是卵巢癌術后復發(fā)的標志物[11]。本研究旨在探討miR-1265在鼻咽癌組織中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年8月在本院耳鼻喉頭頸外科住院治療的鼻咽癌患者60例作為研究組。研究組納入標準：(1)年齡35～75歲；(2)具有詳細的病歷和隨訪資料；(3)病理診斷為鼻咽癌；(4)除鼻咽癌外不存在其他惡性腫瘤。排除標準：(1)術前存在嚴重心血管疾病或惡病質患者；(2)不愿意配合研究或無法配合者。研究組包括男34例、女26例，年齡44～74歲、平均(55.8±11.3)歲。選取同期于本院治療的鼻咽部良性腫瘤患者共60例作為對照組，疾病類型包括鼻腔乳頭狀瘤(24例)、纖維瘤(20例)、血管瘤(3例)及鼻息肉(13例)。對照組包括男30例、女30例，年齡36～67歲、平均(52.3±12.1)歲。對照組納入標準：(1)無惡性腫瘤病史；(2)鼻咽部CT或MRI檢查無惡性腫瘤；(3)病理學檢查符合鼻咽部良性腫瘤的診斷標準[12]。對照組排除標準與研究組相同。所有納入研究的患者均經過電子鼻咽鏡檢查并采集組織標本，獲得病理學確診，TNM分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟第8版標準[13]。兩組患者年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma 公司；細胞裂解液和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；超速離心機購自美國Sigma公司；PCR儀購自美國Bio-Rad 公司;酶標儀購自上海賽默飛世爾公司。組織和血清RNA提取試劑盒、Trizol試劑盒、反轉錄試劑盒、miR-1265 抑制劑和空白對照的干擾RNA、All-in-oneTMmiRNA qPCR 檢測試劑盒、MAT1 mRNA qPCR 檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司。雙熒光素酶報告基因分析實驗檢測試劑盒購自北京碧云天生物技術公司。

1.3方法

1.3.1兩組患者的血液和組織標本收集 兩組患者于入院后次日抽取上肢靜脈血10 mL，離心后保存于-20 ℃冰箱待測。研究組的鼻咽癌組織標本(60例)和對照組的鼻咽部良性腫瘤組織標本(60例)保存于-80 ℃冰箱待測。

1.3.2兩組患者組織和血清中miR-1265的相對表達水平檢測 將兩組患者組織標本勻漿用于RNA提取，血清標本直接用于提取RNA,采用Trizol試劑提取組織或血清中的總RNA。用紫外分光光度計于260 nm和280 nm波長處測定RNA提取液的吸光度(A)值，檢測RNA純度和濃度。采用反轉錄試劑盒進行RNA反轉錄，分別將2 μg RNA、1 μL Oligo(dT)和8 μL DEPC 水加入PCR 管中，微型離心機離心后混勻，按試劑盒說明書所列方法配制PCR反應體系：每組體系加入10 μL RNA模板，總體系為25 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性5 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。miR-1265的相對表達水平檢測采用All-in-oneTMmiRNA qPCR 檢測試劑盒進行反應，以U6作為內參，應用2-ΔΔCT法計算miRNA的相對表達水平。

1.3.3靶基因預測 通過miRNA靶基因在線預測網(wǎng)站TargetScan預測miR-1265的靶基因，其原理是通過查找Mer位點與miRNA的種子區(qū)域的匹配來預測靶基因。

1.3.4miR-1265靶基因的驗證 及雙熒光素酶報告基因分析實驗按試劑盒操作手冊進行。簡要步驟如下：取生長良好的鼻咽癌CNE-2細胞(來自于本實驗室培養(yǎng)的細胞系)，分別轉染miR-1265 抑制劑(miR-1265 inhibator)和抑制劑的空白對照，在轉染miR-1265 inhibator后的細胞中分別轉染含有轉移相關蛋白1(MAT1)-3 UTR 野生型和突變型的質粒，檢測轉染后細胞內熒光素酶的相對活性。

1.3.5兩組患者組織中MAT1 mRNA的相對表達水平檢測 兩組患者病理組織中RNA提取和檢測方法同1.3.2，上下游引物分別為：5′-ACCTACAACCGATAGCTGCTG-3′和5′-TTCCGATCTGCTTGTACTGCA-3′。GAPDH為內參基因，應用2-ΔΔCT法計算MAT1 mRNA的相對表達水平。

2 結 果

2.1兩組患者病理組織和血清中miR-1265相對表達水平的比較 研究組病理組織中miR-1265相對表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；研究組血清中miR-1265相對表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者病理組織和血清中miR-1265相對表達水平的比較

2.2鼻咽癌患者癌組織中miR-1265的相對表達水平與臨床病理因素的關系 不同性別、年齡及病理類型患者間miR-1265的相對表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同TNM分期、病理分期和淋巴結轉移的患者miR-1265相對表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 鼻咽癌患者癌組織中miR-1265相對表達水平與臨床病理因素的關系

2.3組織和血清中miR-1265的相對表達水平對鼻咽癌的診斷價值 當病理組織中miR-1265截斷值為0.895時，Youden指數(shù)最大，其診斷鼻咽癌的ROC曲線AUC為0.917，95%CI為0.878～0.946，靈敏度為87.3%，特異度為91.3%；當血清中miR-1265截斷值為0.515時，Youden指數(shù)最大，其診斷鼻咽癌的ROC曲線AUC為0.717，95%CI為0.678～0.806，靈敏度為67.3%，特異度為71.3%，見圖1。

圖1 鼻咽癌患者組織和血清中miR-1265的相對表達水平診斷鼻咽癌的ROC曲線

2.4MAT1基因是miR-1265的靶基因 通過TargetScan尋找miR-1265的靶基因，結果發(fā)現(xiàn)MAT1 3′-UTR的835-845處含有保守的miR-1265同源位點，提示在多種腫瘤細胞中高表達的癌基因MAT1是miR-1265的靶基因，見圖2A；雙熒光素酶報告基因分析實驗顯示：轉染MAT1野生型3′-UTR載體在miR-1265 inhibitor 刺激下螢火蟲熒光素與海腎熒光素的比值明顯下降(P<0.05)，而轉染MAT1突變型3′-UTR載體在miR-1265 inhibitor刺激下螢火蟲熒光素與海腎熒光素的比值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，MAT1為miR-1265的靶基因，見圖2B。

2.5研究組和對照組中MAT1 mRNA 表達水平比較 研究組病理組織中MAT1 mRNA相對表達水平為0.731±0.311，對照組為2.413±0.425，研究組病理組織中MAT1 mRNA相對表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.498,P<0.001)。

注：A表示miR-1265與預測靶點MAT1的結合位點；B表示雙熒光素酶報告基因分析實驗驗證miR-1265與MAT1的靶向結合；*表示P<0.05。

2.6MAT1 mRNA 和miR-1265的相關性 Pearson相關顯示鼻咽癌組織中MAT1 mRNA與miR-1265的相對表達水平呈負相關(r=-0.943,P<0.001),見圖3。

圖3 鼻咽癌患者癌組織中MAT1 mRNA 和miR-1265的相對表達水平的相關性分析

3 討 論

鼻咽癌好發(fā)于我國南方地區(qū)，發(fā)病率在頭頸惡性腫瘤中居首位，以低分化鱗癌為主[14]。鼻咽癌早期癥狀復雜多樣缺乏特異性，腫瘤部位常較為隱蔽，導致早期檢出率較低，約為60%。鼻咽癌患者確診時已經發(fā)生腫瘤細胞擴散和轉移，導致治療效果不佳，嚴重影響患者的生存[15]，探討鼻咽癌發(fā)病機制和新的診斷方法對改善鼻咽癌患者預后意義重大。

miRNA是真核細胞內無編碼作用的小RNA，僅由19～25個核苷酸序列組成，在腫瘤細胞的凋亡、遷移、增殖等過程中發(fā)揮調控作用[16]。miR-1265是最新鑒定的微小RNA，在結直腸癌高通量測序中發(fā)現(xiàn)其在癌組織中表達水平高于癌旁組織[9]。最新研究發(fā)現(xiàn)在胃癌患者癌組織中 miR-1265相對表達水平較癌旁組織上調，其血清中miR-1265相對表達水平也高于健康人群[8]，體外研究發(fā)現(xiàn)miR-1265表達上調可促進胃癌細胞增殖、抑制癌細胞凋亡，減弱癌細胞中自噬蛋白表達，促進胃癌的進展，發(fā)揮致癌基因的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌癌組織中miR-1265相對表達水平較鼻咽部良性腫瘤組織顯著上調，同時鼻咽癌患者血清中miR-1265相對表達水平也高于鼻咽部良性腫瘤患者，提示其可能在鼻咽癌中發(fā)揮促癌作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中miR-1265的相對表達水平與TNM分期、病理分期和淋巴結轉移等惡性腫瘤的臨床病理特征相關，其中TNM分期越晚、病理分期為進展型和存在淋巴結轉移的患者癌組織中miR-1265的相對表達水平較高，提示miR-1265 可能參與鼻咽癌進展，而miR-1265 的相對高表達代表鼻咽癌患者癌細胞存在較晚的臨床分期、較高侵襲性及惡性程度。

鼻咽部腫瘤良惡性的鑒別診斷一直是臨床研究的熱點[17]。 鼻咽癌腫瘤部位常較隱蔽，診斷缺乏特異性，同時鼻咽部存在多種良性腫瘤，常導致鼻咽癌易漏診和鼻咽癌早期檢出率較低[18]。本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中miR-1265的相對表達水平可有效區(qū)分鼻咽癌和鼻咽部良性腫瘤，其診斷的AUC為0.917，靈敏度為87.3%，特異度為91.3%，進一步研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌血清中的miR-1265診斷鼻咽癌的AUC為0.717，靈敏度為67.3%，特異度為71.3%，有一定的診斷價值，且血清miR-1265 的相對表達水平不需要取得活檢組織，具有成為鼻咽癌無創(chuàng)診斷標志物的潛能[19]。

MAT1基因是常見的致癌基因，其高表達與多種癌癥發(fā)生、進展和預后密切相關[20]。MAT1 基因位于14q23.1 位點上，通過調節(jié)細胞周期蛋白依賴性激酶7 (CDK7) 和細胞周期蛋白依賴性激酶H(CDKH)發(fā)揮作用，其高表達促進細胞增殖，且與乳腺癌預后密切相關[21]。在其他癌癥中，如結直腸癌[22]和非小細胞肺癌[23]癌組織標本中的MAT1 基因表達水平有助于不良預后的判斷，且MAT1 基因可能成為潛在的癌癥治療靶點。最新研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中MAT1 mRNA 和蛋白均在癌組織中低表達，而在癌旁組織中高表達，且可用于判斷鼻咽癌的不良預后，提示MAT1 基因參與了鼻咽癌的進展[24]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1265的潛在靶基因是MAT1，采用雙熒光素報告基因分析實驗驗證miR-1265潛在的靶基因是MAT1基因，而且鼻咽癌患者癌組織中MAT1 mRNA 的相對表達水平低于鼻咽部良性腫瘤患者，鼻咽癌患者癌組織中MAT1 mRNA 的相對表達水平與miR-1265相對表達水平呈負相關。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1265的靶基因是MAT1 基因，是否可通過敲低miR-1265表達水平，進而上調MAT1 基因表達而治療鼻咽癌尚待進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者癌組織和血清中miR-1265表達上調，與鼻咽癌進展密切相關，且具有鑒別診斷鼻咽癌和鼻咽部良性腫瘤的能力，其靶基因是MAT1基因，且鼻咽癌組織中miR-1265相對表達水平與MAT1呈負相關。miR-1265和MAT1基因有應用于鼻咽癌診斷的潛在價值或成為鼻咽癌治療的新靶點。