血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測對乙型肝炎相關早期肝細胞癌的診斷價值*

李 洪,馮雪晶,秦 維,莊恢勇

瓊海市人民醫(yī)院檢驗科，海南瓊海 222000

肝細胞癌在所有肝癌病例中占較大比例，是全球五大常見惡性腫瘤之一[1]。乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝細胞癌發(fā)生的主要危險因素。由于早期肝細胞癌臨床診斷困難，只有30%～40%的患者能行根治性切除術治療[2]。在目前的診斷方案中，甲胎蛋白(AFP)是篩選肝細胞癌的生物標志物[3]，但AFP的靈敏度僅為39%～56%，特異度為76%～93%，約三分之一的肝細胞癌患者不能通過AFP檢測確診[4]。微小RNA(miRNA)是一類具有19～22個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA[5]。在乙型肝炎(簡稱乙肝)相關早期肝細胞癌患者中，外泌體miR-15b、miR-224、miR-501異常表達[6]。然而，關于上述幾種miRNA能否作為診斷乙肝相關早期肝細胞癌的生物標志物國內未見報道，所以本研究對此進行了探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年12月本院收治的乙肝相關早期肝細胞癌患者120例作為肝癌組，男61例、女59例，年齡(53.56±5.62)歲；選取肝炎患者120例作為肝炎組，肝炎病毒檢測為陽性，病程超過半年，有乏力、食欲缺乏、惡心、腹脹、肝區(qū)疼痛等癥狀，男64例、女56例，年齡(52.61±8.23)歲。本研究中乙肝的診斷均符合《病毒性肝炎防治方案》中的相關標準[7]；乙肝相關早期肝細胞癌的診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》中的標準[8]。排除標準：(1)接受過相應的藥物治療；(2)有嚴重心、腎功能損害者；(3)長期使用皮質類固醇激素及免疫抑制劑者；(4)精神疾病患者；(5)同時患有其他癌癥者。另外，將同期于本院接受體檢的健康者120例作為對照組，男60例、女60例，年齡(50.65±10.59)歲。各組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲本院倫理委員會批準，且受試者均簽署知情同意書。

1.2方法 抽取上述人群肘前靜脈血20 mL，靜置20 min后，以2 500 r/min離心15 min分離血清。取4 mL血清后，加入34 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，移至超速離心管，經配平后于4 ℃以150 000×g離心70 min獲取血清外泌體。采用外泌體RNA分離試劑盒(北京金優(yōu)科技有限公司)進行RNA的提取：裂解外泌體后加入氯仿，靜置后離心得到上層的水相RNA層，再加入無水乙醇沉淀RNA，經RWT緩沖液和RPE緩沖液洗脫后再用DEPC水收集得到RNA溶液。隨即采用反轉錄試劑盒(昆明迪然科技有限公司)進行反轉錄制備cDNA。采用實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(北京吉田生物科技有限公司)配制擴增體系，進行qPCR檢測，通過循環(huán)閾值(Ct值)計算miRNA的相對表達水平。

2 結 果

2.13組間血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501相對表達水平的比較 肝癌組和肝炎組患者血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501相對表達水平高于對照組，肝癌組高于肝炎組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組間血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501 相對表達水平的比較

2.2血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌和肝炎鑒別診斷的效能 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌和肝炎鑒別診斷的效能指標見表2，截斷值分別為1.384、0.749、0.960。

表2 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌和肝炎鑒別診斷的效能

2.3血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌診斷的效能 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌診斷的效能指標見表3，截斷值分別為0.558、0.227、0.274。

表3 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌診斷的效能

2.4血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501聯(lián)合檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌的診斷 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501聯(lián)合檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌診斷的靈敏度為93.33%(112/120)，特異度為92.92%(223/240)，準確度為93.05%(335/360)。見表4。

表4 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501聯(lián)合檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌診斷的分析(n)

3 討 論

慢性肝病有發(fā)展為肝細胞癌的可能，對慢性肝病患者而言這是嚴重的健康隱患。因此，肝細胞癌的早診斷、早治療至關重要。本研究檢測了3組人群的血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501水平，然后進行了ROC曲線分析，發(fā)現血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501聯(lián)合檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌診斷的靈敏度為93.33%，特異度為92.92%，準確度為93.05%。本研究中，盡管各項指標單獨檢測的特異度和靈敏度并不低于聯(lián)合檢測，但是血清外泌體miRNA屬于間接標志物，會受到患者各種因素的影響，聯(lián)合檢測能減少這些影響。

miRNA可在轉錄后調節(jié)基因表達，與許多生物學過程有關，如發(fā)育、細胞分化、增殖、凋亡和炎癥[9]。在包括肝細胞癌在內的許多癌癥中都發(fā)現了miRNA的異常表達，它們具有致癌或抑癌特性[10]。本研究發(fā)現，肝癌組患者血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501的相對表達水平明顯高于肝炎組，而且肝癌組、肝炎組均明顯高于對照組。抑制miR-224的表達可顯著降低基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)的基因和蛋白表達，MMP-2是促進腫瘤遷移的重要蛋白[11]，這說明肝細胞癌患者血清外泌體高表達miR-224可能與肝細胞癌的侵襲、遷移能力相關。另外，陳帥等[12]發(fā)現miR-501在肺腺癌標本中呈高表達，與本研究發(fā)現的miR-501在肝細胞癌患者血清外泌體高表達的現象一致；此外，上調miR-501表達可抑制其靶基因CYLD的表達，并進一步引起下游基因C-myc和Cyclin D1的表達升高，由此造成肝癌細胞的高增殖活性。由此可見，miR-224、miR-501可能與乙肝相關早期肝細胞癌的進展和轉移有關。

外泌體是小的膜泡，大小為30～120 nm，來自內部多泡體(MVB)[13]。外泌體已經在包括血液、腹水、尿液和唾液在內的體液中被發(fā)現[14]。研究表明，外泌體非編碼RNA以一種穩(wěn)定的形式存在，不受內源性RNA酶的干擾，它們可能是細胞間通信的重要介質[15]。因此，相較于血清AFP的篩查，血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501更加穩(wěn)定。外泌體包含不同的miRNA組分，這主要取決于不同的器官和疾病狀態(tài)，這可能反映了器官組織起源細胞的分子特征[16]。腫瘤來源的外泌體含有腫瘤特異性的miRNA，它們在腫瘤進展和轉移中發(fā)揮作用[17]。目前，AFP作為篩選肝細胞癌的生物標志物，靈敏度、特異度不夠理想，本研究發(fā)現血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測在靈敏度和特異度方面均有明顯優(yōu)勢。

綜上所述，血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501可作為診斷乙肝相關早期肝細胞癌的潛在標志物。