血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測(cè)對(duì)乙型肝炎相關(guān)早期肝細(xì)胞癌的診斷價(jià)值*

李 洪,馮雪晶,秦 維,莊恢勇

瓊海市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南瓊海 222000

肝細(xì)胞癌在所有肝癌病例中占較大比例，是全球五大常見(jiàn)惡性腫瘤之一[1]。乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝細(xì)胞癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。由于早期肝細(xì)胞癌臨床診斷困難，只有30%～40%的患者能行根治性切除術(shù)治療[2]。在目前的診斷方案中，甲胎蛋白(AFP)是篩選肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物[3]，但AFP的靈敏度僅為39%～56%，特異度為76%～93%，約三分之一的肝細(xì)胞癌患者不能通過(guò)AFP檢測(cè)確診[4]。微小RNA(miRNA)是一類具有19～22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA[5]。在乙型肝炎(簡(jiǎn)稱乙肝)相關(guān)早期肝細(xì)胞癌患者中，外泌體miR-15b、miR-224、miR-501異常表達(dá)[6]。然而，關(guān)于上述幾種miRNA能否作為診斷乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道，所以本研究對(duì)此進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年12月本院收治的乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌患者120例作為肝癌組，男61例、女59例，年齡(53.56±5.62)歲；選取肝炎患者120例作為肝炎組，肝炎病毒檢測(cè)為陽(yáng)性，病程超過(guò)半年，有乏力、食欲缺乏、惡心、腹脹、肝區(qū)疼痛等癥狀，男64例、女56例，年齡(52.61±8.23)歲。本研究中乙肝的診斷均符合《病毒性肝炎防治方案》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]；乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌的診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》中的標(biāo)準(zhǔn)[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受過(guò)相應(yīng)的藥物治療；(2)有嚴(yán)重心、腎功能損害者；(3)長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑者；(4)精神疾病患者；(5)同時(shí)患有其他癌癥者。另外，將同期于本院接受體檢的健康者120例作為對(duì)照組，男60例、女60例，年齡(50.65±10.59)歲。各組一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2方法 抽取上述人群肘前靜脈血20 mL，靜置20 min后，以2 500 r/min離心15 min分離血清。取4 mL血清后，加入34 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，移至超速離心管，經(jīng)配平后于4 ℃以150 000×g離心70 min獲取血清外泌體。采用外泌體RNA分離試劑盒(北京金優(yōu)科技有限公司)進(jìn)行RNA的提取：裂解外泌體后加入氯仿，靜置后離心得到上層的水相RNA層，再加入無(wú)水乙醇沉淀RNA，經(jīng)RWT緩沖液和RPE緩沖液洗脫后再用DEPC水收集得到RNA溶液。隨即采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(昆明迪然科技有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(北京吉田生物科技有限公司)配制擴(kuò)增體系，進(jìn)行qPCR檢測(cè)，通過(guò)循環(huán)閾值(Ct值)計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.13組間血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501相對(duì)表達(dá)水平的比較 肝癌組和肝炎組患者血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，肝癌組高于肝炎組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組間血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501 相對(duì)表達(dá)水平的比較

2.2血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測(cè)用于乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌和肝炎鑒別診斷的效能 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測(cè)用于乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌和肝炎鑒別診斷的效能指標(biāo)見(jiàn)表2，截?cái)嘀捣謩e為1.384、0.749、0.960。

表2 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測(cè)用于乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌和肝炎鑒別診斷的效能

2.3血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測(cè)用于乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌診斷的效能 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測(cè)用于乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌診斷的效能指標(biāo)見(jiàn)表3，截?cái)嘀捣謩e為0.558、0.227、0.274。

表3 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測(cè)用于乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌診斷的效能

2.4血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501聯(lián)合檢測(cè)用于乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌的診斷 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501聯(lián)合檢測(cè)用于乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌診斷的靈敏度為93.33%(112/120)，特異度為92.92%(223/240)，準(zhǔn)確度為93.05%(335/360)。見(jiàn)表4。

表4 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501聯(lián)合檢測(cè)用于乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌診斷的分析(n)

3 討 論

慢性肝病有發(fā)展為肝細(xì)胞癌的可能，對(duì)慢性肝病患者而言這是嚴(yán)重的健康隱患。因此，肝細(xì)胞癌的早診斷、早治療至關(guān)重要。本研究檢測(cè)了3組人群的血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501水平，然后進(jìn)行了ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501聯(lián)合檢測(cè)用于乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌診斷的靈敏度為93.33%，特異度為92.92%，準(zhǔn)確度為93.05%。本研究中，盡管各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)的特異度和靈敏度并不低于聯(lián)合檢測(cè)，但是血清外泌體miRNA屬于間接標(biāo)志物，會(huì)受到患者各種因素的影響，聯(lián)合檢測(cè)能減少這些影響。

miRNA可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，與許多生物學(xué)過(guò)程有關(guān)，如發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡和炎癥[9]。在包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的許多癌癥中都發(fā)現(xiàn)了miRNA的異常表達(dá)，它們具有致癌或抑癌特性[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組患者血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于肝炎組，而且肝癌組、肝炎組均明顯高于對(duì)照組。抑制miR-224的表達(dá)可顯著降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的基因和蛋白表達(dá)，MMP-2是促進(jìn)腫瘤遷移的重要蛋白[11]，這說(shuō)明肝細(xì)胞癌患者血清外泌體高表達(dá)miR-224可能與肝細(xì)胞癌的侵襲、遷移能力相關(guān)。另外，陳帥等[12]發(fā)現(xiàn)miR-501在肺腺癌標(biāo)本中呈高表達(dá)，與本研究發(fā)現(xiàn)的miR-501在肝細(xì)胞癌患者血清外泌體高表達(dá)的現(xiàn)象一致；此外，上調(diào)miR-501表達(dá)可抑制其靶基因CYLD的表達(dá)，并進(jìn)一步引起下游基因C-myc和Cyclin D1的表達(dá)升高，由此造成肝癌細(xì)胞的高增殖活性。由此可見(jiàn)，miR-224、miR-501可能與乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

外泌體是小的膜泡，大小為30～120 nm，來(lái)自內(nèi)部多泡體(MVB)[13]。外泌體已經(jīng)在包括血液、腹水、尿液和唾液在內(nèi)的體液中被發(fā)現(xiàn)[14]。研究表明，外泌體非編碼RNA以一種穩(wěn)定的形式存在，不受內(nèi)源性RNA酶的干擾，它們可能是細(xì)胞間通信的重要介質(zhì)[15]。因此，相較于血清AFP的篩查，血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501更加穩(wěn)定。外泌體包含不同的miRNA組分，這主要取決于不同的器官和疾病狀態(tài)，這可能反映了器官組織起源細(xì)胞的分子特征[16]。腫瘤來(lái)源的外泌體含有腫瘤特異性的miRNA，它們?cè)谀[瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[17]。目前，AFP作為篩選肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物，靈敏度、特異度不夠理想，本研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測(cè)在靈敏度和特異度方面均有明顯優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501可作為診斷乙肝相關(guān)早期肝細(xì)胞癌的潛在標(biāo)志物。