李 洪,馮雪晶,秦 維,莊恢勇
瓊海市人民醫(yī)院檢驗科,海南瓊海 222000
肝細胞癌在所有肝癌病例中占較大比例,是全球五大常見惡性腫瘤之一[1]。乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝細胞癌發(fā)生的主要危險因素。由于早期肝細胞癌臨床診斷困難,只有30%~40%的患者能行根治性切除術治療[2]。在目前的診斷方案中,甲胎蛋白(AFP)是篩選肝細胞癌的生物標志物[3],但AFP的靈敏度僅為39%~56%,特異度為76%~93%,約三分之一的肝細胞癌患者不能通過AFP檢測確診[4]。微小RNA(miRNA)是一類具有19~22個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA[5]。在乙型肝炎(簡稱乙肝)相關早期肝細胞癌患者中,外泌體miR-15b、miR-224、miR-501異常表達[6]。然而,關于上述幾種miRNA能否作為診斷乙肝相關早期肝細胞癌的生物標志物國內未見報道,所以本研究對此進行了探討。
1.1一般資料 選取2018年1月至2019年12月本院收治的乙肝相關早期肝細胞癌患者120例作為肝癌組,男61例、女59例,年齡(53.56±5.62)歲;選取肝炎患者120例作為肝炎組,肝炎病毒檢測為陽性,病程超過半年,有乏力、食欲缺乏、惡心、腹脹、肝區(qū)疼痛等癥狀,男64例、女56例,年齡(52.61±8.23)歲。本研究中乙肝的診斷均符合《病毒性肝炎防治方案》中的相關標準[7];乙肝相關早期肝細胞癌的診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》中的標準[8]。排除標準:(1)接受過相應的藥物治療;(2)有嚴重心、腎功能損害者;(3)長期使用皮質類固醇激素及免疫抑制劑者;(4)精神疾病患者;(5)同時患有其他癌癥者。另外,將同期于本院接受體檢的健康者120例作為對照組,男60例、女60例,年齡(50.65±10.59)歲。各組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲本院倫理委員會批準,且受試者均簽署知情同意書。
1.2方法 抽取上述人群肘前靜脈血20 mL,靜置20 min后,以2 500 r/min離心15 min分離血清。取4 mL血清后,加入34 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋,移至超速離心管,經配平后于4 ℃以150 000×g離心70 min獲取血清外泌體。采用外泌體RNA分離試劑盒(北京金優(yōu)科技有限公司)進行RNA的提取:裂解外泌體后加入氯仿,靜置后離心得到上層的水相RNA層,再加入無水乙醇沉淀RNA,經RWT緩沖液和RPE緩沖液洗脫后再用DEPC水收集得到RNA溶液。隨即采用反轉錄試劑盒(昆明迪然科技有限公司)進行反轉錄制備cDNA。采用實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(北京吉田生物科技有限公司)配制擴增體系,進行qPCR檢測,通過循環(huán)閾值(Ct值)計算miRNA的相對表達水平。

2.13組間血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501相對表達水平的比較 肝癌組和肝炎組患者血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501相對表達水平高于對照組,肝癌組高于肝炎組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 3組間血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501 相對表達水平的比較
2.2血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌和肝炎鑒別診斷的效能 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌和肝炎鑒別診斷的效能指標見表2,截斷值分別為1.384、0.749、0.960。

表2 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌和肝炎鑒別診斷的效能
2.3血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌診斷的效能 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌診斷的效能指標見表3,截斷值分別為0.558、0.227、0.274。

表3 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌診斷的效能
2.4血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501聯(lián)合檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌的診斷 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501聯(lián)合檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌診斷的靈敏度為93.33%(112/120),特異度為92.92%(223/240),準確度為93.05%(335/360)。見表4。

表4 血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501聯(lián)合檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌診斷的分析(n)
慢性肝病有發(fā)展為肝細胞癌的可能,對慢性肝病患者而言這是嚴重的健康隱患。因此,肝細胞癌的早診斷、早治療至關重要。本研究檢測了3組人群的血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501水平,然后進行了ROC曲線分析,發(fā)現血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501聯(lián)合檢測用于乙肝相關早期肝細胞癌診斷的靈敏度為93.33%,特異度為92.92%,準確度為93.05%。本研究中,盡管各項指標單獨檢測的特異度和靈敏度并不低于聯(lián)合檢測,但是血清外泌體miRNA屬于間接標志物,會受到患者各種因素的影響,聯(lián)合檢測能減少這些影響。
miRNA可在轉錄后調節(jié)基因表達,與許多生物學過程有關,如發(fā)育、細胞分化、增殖、凋亡和炎癥[9]。在包括肝細胞癌在內的許多癌癥中都發(fā)現了miRNA的異常表達,它們具有致癌或抑癌特性[10]。本研究發(fā)現,肝癌組患者血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501的相對表達水平明顯高于肝炎組,而且肝癌組、肝炎組均明顯高于對照組。抑制miR-224的表達可顯著降低基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)的基因和蛋白表達,MMP-2是促進腫瘤遷移的重要蛋白[11],這說明肝細胞癌患者血清外泌體高表達miR-224可能與肝細胞癌的侵襲、遷移能力相關。另外,陳帥等[12]發(fā)現miR-501在肺腺癌標本中呈高表達,與本研究發(fā)現的miR-501在肝細胞癌患者血清外泌體高表達的現象一致;此外,上調miR-501表達可抑制其靶基因CYLD的表達,并進一步引起下游基因C-myc和Cyclin D1的表達升高,由此造成肝癌細胞的高增殖活性。由此可見,miR-224、miR-501可能與乙肝相關早期肝細胞癌的進展和轉移有關。
外泌體是小的膜泡,大小為30~120 nm,來自內部多泡體(MVB)[13]。外泌體已經在包括血液、腹水、尿液和唾液在內的體液中被發(fā)現[14]。研究表明,外泌體非編碼RNA以一種穩(wěn)定的形式存在,不受內源性RNA酶的干擾,它們可能是細胞間通信的重要介質[15]。因此,相較于血清AFP的篩查,血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501更加穩(wěn)定。外泌體包含不同的miRNA組分,這主要取決于不同的器官和疾病狀態(tài),這可能反映了器官組織起源細胞的分子特征[16]。腫瘤來源的外泌體含有腫瘤特異性的miRNA,它們在腫瘤進展和轉移中發(fā)揮作用[17]。目前,AFP作為篩選肝細胞癌的生物標志物,靈敏度、特異度不夠理想,本研究發(fā)現血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501檢測在靈敏度和特異度方面均有明顯優(yōu)勢。
綜上所述,血清外泌體miR-15b、miR-224、miR-501可作為診斷乙肝相關早期肝細胞癌的潛在標志物。