LAMP芯片十三聯(lián)法檢測重癥監(jiān)護患者下呼吸道感染病原菌的應用價值*

李 曉，楊永泉，孫朝暉，張衛(wèi)云

中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510010

下呼吸道感染在世界十大死亡病因中排名第四，在發(fā)展水平較低的國家中，下呼吸道感染疾病在死亡原因中排名更靠前[1]，在我國也是最常見的疾病之一。肺炎作為全球感染性疾病最主要的死因之一，若發(fā)生在重癥監(jiān)護患者中，尤其需要引起重視。下呼吸道感染絕大多數(shù)以革蘭陰性(G-)桿菌為主要致病菌，因此明確引起感染的病原菌，選擇合理的抗菌藥物治療是臨床迫切需要的[2]。目前臨床鑒定病原菌的方法主要依靠細菌培養(yǎng)法，但煩瑣又費時，而環(huán)介導等溫擴增檢測(LAMP)芯片法可在1～2 h內定性檢測下呼吸道分泌物中的13種病原菌(包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌、嗜肺軍團菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、結核分枝桿菌)，該技術可應用于細菌、病毒、真菌等一系列病原微生物的檢測[3-4]，大大提高了呼吸道感染的病原學診斷水平，可及時指導醫(yī)師合理使用抗菌藥物[5-6]。LAMP芯片法與痰培養(yǎng)法比較，前者具有特異度和靈敏度較高的優(yōu)勢，對于培養(yǎng)周期長或者難培養(yǎng)的病原菌可進行快速鑒定，對指導臨床治療具有較高價值[7-8]。本研究擬采用LAMP芯片法檢測重癥監(jiān)護患者下呼吸道感染病原菌，并與痰培養(yǎng)法進行比較，探討2種方法檢測的一致性和臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年6月至2019年12月本院重癥監(jiān)護病房疑似下呼吸道感染患者67例，其中男49例、女18例，平均年齡(68.3±22.1)歲，采集深部痰液和肺泡灌洗液標本。應用LAMP芯片法檢測上述患者的13種常見下呼吸道病原菌，對同一患者還同時進行痰培養(yǎng)檢查，比較2種方法的差異，對檢測結果的一致性進行分析。

1.2儀器與試劑 LAMP芯片法儀器和試劑均為北京博奧生物集團有限公司生產(chǎn)，包括核酸分析儀、呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒和恒溫擴增芯片。用于液化痰液的10%NaOH溶液由本科室自行配制。痰培養(yǎng)病原菌鑒定采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的API微生物分析系統(tǒng)及配套試劑。

1.3方法

1.3.1樣本收集 采用經(jīng)氣管內吸痰取深部痰液或者肺泡灌洗液，樣本量不少于0.6 mL置于無菌容器內于2 h內送檢，在所有患者暫未使用抗菌藥物治療時進行。

1.3.2樣本檢測 LAMP芯片法：痰液或肺泡灌洗液標本中按1∶1加入10%NaOH溶液，靜置30 min左右，待標本完全液化后取1 mL液體按試劑盒說明書操作步驟提取核酸，提取好的核酸加入恒溫擴增芯片中，上機檢測[9-10]。痰培養(yǎng)法：痰液或肺泡灌洗液在平板上接種后置于37 ℃二氧化碳溫箱中培養(yǎng)，將生長的優(yōu)勢菌確定為致病菌，然后采用全自動微生物鑒定儀進行鑒定。

1.4結果判斷 LAMP芯片法可同時完成13種下呼吸道常見病原菌的靶基因擴增和檢測，擴增芯片內設有1個陽性內參和9個陰性質控及1個人基因組DNA用于檢測質控，結果判讀時陽性質控應為陽性，陰性質控結果均為陰性，且陽性標本呈典型的S形擴增曲線可判斷結果為陽性。根據(jù)《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第 3版規(guī)定，痰培養(yǎng)采用密集劃線法進行計數(shù)培養(yǎng)，以菌落數(shù)≥104CFU/mL為陽性，<104CFU/mL為污染[11]。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)，列表方法分析菌株分布，痰培養(yǎng)法與LAMP芯片法陽性率比較采用χ2檢驗；采用Kappa檢驗進行一致性分析，Kappa>0.40為具有一致性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1LAMP芯片法檢測菌株分布 67例重癥監(jiān)護病房下呼吸道感染患者，LAMP芯片法檢出病原菌陽性52例，陽性率77.61%(52/67)。檢出菌株114株，包含9種病原菌，其中革蘭陽性(G+)菌占24.56%(28/114)，G-菌74.56%(85/114)。未檢出肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團菌及肺炎鏈球菌，見表1。檢出單菌株21例、混合菌株31例，其中2種菌株14例，3種菌株9例，4種菌株5例，5種、6種及7種混合菌株各1例，見表2。

表1 LAMP芯片法檢測病原菌菌株分布[ n(%)]

表2 LAMP芯片法檢測出的單菌株/混合菌情況

2.2痰培養(yǎng)法檢測菌株分布 重癥監(jiān)護病房下呼吸道感染患者標本67例，其痰液標本培養(yǎng)以檢出優(yōu)勢菌株判定為陽性，共檢出陽性44例，陽性率65.67%(44/67)。檢出菌株44株，包含7種病原菌，其中G+菌占4.54%(2/44)，G-菌占93.19%(41/44)。未檢出大腸埃希菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團菌及肺炎鏈球菌病原菌，見表3。

表3 痰培養(yǎng)法檢測病原菌菌株分布

2.3LAMP芯片法與痰培養(yǎng)法陽性率比較 LAMP芯片法檢出下呼吸道感染病原菌陽性率高于痰培養(yǎng)法(77.61%vs.65.67%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=20.589，P<0.05)。2種方法檢出病原菌的陽性符合率較一致(Kappa=0.567)，見表4。分析2種方法檢測各菌種的一致性，LAMP芯片法與痰培養(yǎng)法對鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、結核分枝桿菌檢測具有一致性(Kappa>0.40)，而對耐甲氧西林葡萄球菌、金黃色葡萄球菌的檢測不具有一致性(Kappa<0.40)，見表5。

表4 LAMP芯片法與痰培養(yǎng)法檢測病原菌的一致性分析(n)

表5 LAMP芯片法與痰培養(yǎng)法檢測各病原菌結果的一致性分析(n)

3 討 論

下呼吸道感染是重癥監(jiān)護病房患者最常見的疾病之一，嚴重影響患者康復，不容忽視。細菌是下呼吸道感染病原菌的重要組成部分，痰培養(yǎng)法在檢測下呼吸道病原菌的靈敏度和檢測時間上難以滿足臨床患者的要求。本研究采用的LAMP芯片法同時檢測13種下呼吸道病原菌，具有時間短、操作簡單、特異度和敏感度高等優(yōu)勢，該方法具備了對呼吸道感染性疾病的快速診斷能力[12-13]。

本研究顯示，LAMP芯片法檢測下呼吸道感染病原菌的陽性率高于痰培養(yǎng)法(77.61%vs.65.67%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，因此LAMP芯片法能快速確定感染病原體，醫(yī)生可根據(jù)檢測結果正確選擇抗菌藥物，使患者得到及時有效治療，大大縮短患者感染急性期及住院時間，減少細菌耐藥性的產(chǎn)生。2種方法檢測病原菌具有一致性，對鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、結核分枝桿菌檢測的檢測具有一致性，而對耐甲氧西林葡萄球菌和金黃色葡萄球菌的檢測不具有一致性，與以往文獻[14]報道基本一致，分析原因可能是LAMP芯片法檢測病原菌的靈敏度更高，而痰培養(yǎng)法檢測耐甲氧西林葡萄球菌和金黃色葡萄球菌容易受標本污染或實驗室檢測條件的限制，漏檢部分病原菌，因此LAMP芯片法檢測的病原菌更能真實地反映下呼吸道感染疾病。研究發(fā)現(xiàn)LAMP芯片法對嗜麥芽窄食單胞菌檢出率較高，分析原因可能是該方法學檢測的靈敏度更高，能從微量核酸中擴增出所需的目的基因[15]。同時，本研究的研究對象是重癥監(jiān)護患者，或與患者合并肺部感染、不規(guī)范使用抗菌藥物、長期使用糖皮質激素、使用免疫抑制劑和機械通氣時間≥7 d等原因有關[16]。

本院重癥監(jiān)護病房患者下呼吸道感染病原菌檢出的致病菌以G-菌為主(74.56%)，其中陽性率最高的是鮑曼不動桿菌(20.18%)，其次是肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌(19.30%和13.16%)，均為重要的醫(yī)院致病菌，這與以往檢測結果一致[17-21]。分析原因可能是重癥監(jiān)護病房環(huán)境特殊，患者本身基礎疾病多，常有生理功能紊亂，免疫功能下降，有創(chuàng)診療率高于普通病房，大量廣譜抗菌藥物及免疫抑制劑的應用等。鮑曼不動桿菌檢出率居首位，該菌是醫(yī)院感染的重要病原菌。免疫力較差的住院患者和嚴重的呼吸道疾病患者易發(fā)生多重耐藥鮑曼不動桿菌感染[17-19]，嚴重威脅患者生命。銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌檢出率僅次于鮑曼不動桿菌，可能是因為重癥監(jiān)護病房患者免疫力低、基礎疾病多以及長期使用抗菌藥物，導致感染銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌風險較高[20-21]。G+菌檢出率最高的是耐甲氧西林葡萄球菌，該菌具有多重耐藥性，是獲得性肺炎的重要致病菌[22-23]。

綜上所述，痰培養(yǎng)法雖然價格低廉，可區(qū)分定植菌和致病菌，能分辨優(yōu)勢菌株，并且能有針對性地進行藥敏試驗，但檢測周期長，陽性率較低，難以培養(yǎng)非典型病原菌。而LAMP芯片法檢測下呼吸道感染病原菌雖然缺乏藥物敏感性的檢測結果，但檢測周期短、靈敏度高，而且可檢測非典型病原菌如嗜肺軍團菌、結核分枝桿菌，是診斷下呼吸道感染更為快速、簡便、靈敏的方法，LAMP芯片法作為新技術，更有利于感染的早期干預，其檢測結果可用于指導臨床用藥。