外源蛋白在CHO細(xì)胞染色體上一個(gè)新位點(diǎn)的定點(diǎn)整合和穩(wěn)定表達(dá)

胡灣灣，丁學(xué)峰，蔡燕飛，陳 蘊(yùn)，段作營，金 堅(jiān)，李華鐘*

（1江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無錫214122；2江南大學(xué)藥學(xué)院，無錫214122）

中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞是當(dāng)前生物制藥領(lǐng)域廣泛使用的宿主細(xì)胞，生產(chǎn)了超過70%的治療性蛋白質(zhì)［1-2］。構(gòu)建CHO工程細(xì)胞的傳統(tǒng)方法是將外源基因隨機(jī)整合至細(xì)胞基因組內(nèi)，經(jīng)過多輪篩選獲得重組細(xì)胞系。此方法耗時(shí)費(fèi)力，并且重組CHO細(xì)胞在生產(chǎn)過程中易丟失目的基因，導(dǎo)致非生產(chǎn)性細(xì)胞克隆逐漸增多，不利于生產(chǎn)及監(jiān)管［3］。尋找穩(wěn)定的整合位點(diǎn)，將外源基因定點(diǎn)整合至CHO細(xì)胞基因組的穩(wěn)定位點(diǎn)，可有效縮短工程細(xì)胞株的構(gòu)建周期并解決表達(dá)不穩(wěn)定問題［4］。

初始位點(diǎn)的選擇對(duì)后期的穩(wěn)定表達(dá)起著決定性作用，經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)了一些潛在熱點(diǎn)，如人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080中14號(hào)染色體上的Ighg2基因、21號(hào)染色體上Gr ik1基因中第12個(gè)外顯子—第13個(gè)內(nèi)含子區(qū)域［5］；CHO-S和HEK293T細(xì)胞的Hi pp11基因［6］等。雖然有許多關(guān)于穩(wěn)定位點(diǎn)的研究，但是目前CHO細(xì)胞還未有穩(wěn)定性高、產(chǎn)量理想的整合位點(diǎn)成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)［6］。因此，CHO細(xì)胞基因組穩(wěn)定位點(diǎn)的尋找發(fā)現(xiàn)，并探索構(gòu)建定點(diǎn)整合的穩(wěn)定高產(chǎn)細(xì)胞株，對(duì)生物藥的研發(fā)生產(chǎn)有著重大意義。

本研究團(tuán)隊(duì)前期敲除了Bcl-2家族中促凋亡Bak和Bax基因獲得了抗凋亡特性明顯提升的Bak-/Bax-CHO-K1細(xì)胞株（Ie3），應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染和染色體步移技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了該細(xì)胞基因組內(nèi)可表達(dá)示蹤基因Zs green1的多個(gè)位點(diǎn)［7］。其中一個(gè)位點(diǎn)位于染色體NW_003614241.1上，在LOC103162683基因和Cob l l1基因之間，富含AT堿基。Cob ll1基因編碼蛋白質(zhì)cordon-bleu WH2 repeat protein like 1，主要與人慢性淋巴細(xì)胞白血病和形成胰島素抵抗相關(guān)［8-11］，而在CHO細(xì)胞中的功能尚不明確。……