甘薯與海邊近緣野生種（厚藤）雜交親和性測試和分析

張雄堅 黃立飛 房伯平 陳景益 王章英 羅忠霞 楊義伶

(廣東省農業科學院作物研究所/廣東省作物遺傳改良重點實驗室 廣東廣州 510640)

野生種質資源在甘薯育種中，具有重要作用，主要是利用其抗病蟲及抗逆特性，并能達到一定的效果［1-2］。在抗逆性方面，利用海邊灘涂近緣野生種厚藤的特異性，培育耐鹽甘薯品種，是非常有益的探討研究。海邊近緣野生種厚藤，中文學名馬鞍藤，拉丁文名Ipomoea pes-caprae（L.）R.Br.subsp.Brasiliensis，別名厚藤、鱟藤、二葉紅薯、獅藤、馬蹄金、馬蹄草、海茹藤，染色體2n＝2x＝30［3］，生長在海灘，屬于沿海地區廣泛分布的固沙綠化植物。研究表明，鹽脅迫下，隨著鹽濃度的升高，可溶性糖、游離脯氨酸、厚藤可溶性蛋白以及Na+/K+升高，膜透性增加，說明厚藤是一種耐高鹽植物［4］；鹽脅迫下，馬鞍藤MDA、Pro、可溶性糖、總蛋白含量與凈光合速率等5項指標均呈現出規律性變化，可作為馬鞍藤鹽脅迫的響應指標，能夠迅速和有效地通過自身調節來抵御鹽脅迫帶來的影響，具有較強的耐鹽能力，為耐鹽甘薯種質資源創新和耐鹽基因挖掘提供了理論依據［5］。厚藤作為甘薯的近緣海邊野生種，除具有極強的耐鹽耐旱性外，也是海洋植物藥材，是中國南方沿海地區民間常用海洋中藥和京族習用植物藥材，同時也是澳大利亞、墨西哥、泰國、巴西、巴基斯坦等多個熱帶及亞熱帶國家的傳統藥用植物，其化學成分主要包括樹脂糖苷類、萜類、黃酮類、酚酸類、揮發性成分、甾體類等?，F代藥理研究表明，厚藤具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、鎮痛、抗膠原酶、抗氧化、免疫調節等多種藥理活性［6］。為探究甘薯近緣海邊野生種厚藤的抗逆、藥效基因，以便利用其潛在的基因資源，已在基因和分子水平方面開展了相關研究。先是測定基因組大小及收集特征信息，為馬鞍藤進一步的全基因組深度測序和甘薯耐鹽基因挖掘奠定基礎［7］。通過對厚藤ASR（ABA-stressripening）基因IpASR的克隆和序列分析，明確該基因的生物學功能是作為厚藤體內的重要脅迫應答基因，在適應濱海高鹽干旱環境的過程中發揮重要作用，為作物的抗逆分子育種提供理論依據［8］。已成功克隆厚藤的Actin基因IpActin1，為后續克隆厚藤的抗逆功能基因和分析基因表達模式提供了內參基因，同時也為進一步研究厚藤的抗逆分子機制奠定基礎［9］。利用厚藤與甘薯進行常規雜交，通過分子標記輔助育種，可達到提高甘薯抗逆性和增強其保健功效的目的，這也是可行的研究和必要的探討。但無論是有性雜交還是體細胞雜交，能夠與甘薯雜交并成功獲得種間雜種的野生資源有限，目前僅報道4個種：I.trifida（2X，4X，6X）、I.1triloba、I.1lacunosa、I.cairica［2］，尚未見有關近緣野生種厚藤與甘薯雜交的研究報道。因此，本研究擬測定近緣野生種厚藤與甘薯有性雜交的親和性，為進一步嘗試厚藤與甘薯的有性雜交、結實和種子收獲提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

耐鹽的海邊近緣野生種厚藤（Ipomoea pescaprae），采自廣東省陽江市沿海地區，甘薯［Ipomoea batatas（L.）Lam，2n＝6X＝90］品種共有14個，包括廣薯87、廣薯79、廣紫薯2號、廣紫薯10號、三色甘薯、黔菜2號、廣薯12-87、越南紫薯、綿紫薯9號、心香、廣薯菜9號、廣薯69、廣薯205、普薯32，均來自廣東省農科院作物所甘薯研究室，作為甘薯雜交親本。

1.2 方法

為了使雜交期間能夠開花，甘薯親本和厚藤都用嫁接誘導。以另一個近緣野生種樹牽牛（Ipomoea carneasubsp.fistulosa）作砧木，分別以甘薯親本和厚藤苗6～8 cm長的頂芽為接穗；用15 mg/L奈乙酸（NAA）蘸浸接穗楔尖，然后用保鮮尼龍膜包扎嫁接；嫁接后用大棚遮光網遮陰。待親本正常生長后，于2017年至2020年開花期間（從10月份至次年6月份），根據開花情況，將甘薯品種與厚藤配對組合，進行授粉雜交；采用雌蕊染色速測法［10］觀察花粉萌發情況。上午將甘薯品種與近緣野生種進行授粉雜交，4 h后，取雌蕊染色壓片，在倒署置顯微鏡（型號Olympus CX X41）下觀察花粉萌發，計算親和指數，評價親和強弱，確定親和性。染料制備：將苯酚、甘油、乳酸、蒸餾水按體積比例為1∶1∶1∶1.5混合，加曙紅染色劑，經加熱溶解過濾制成；于2020年3月27日上午，觀察3個組合授粉雜交后的結實掛果情況。

雜交授粉時，若花粉粒不萌發，看不到花粉管，表示完全不親和；若萌發的花粉管清晰、數量多、發育正常且穩定，則表示完全親和。但多數處于這兩者的中間狀態，即花粉管有的模糊不清，有的少，有的多，有的不正常，表明親和性有所差異，據此估算親和指數，評價親和性程度。甘薯品種與近緣野生種厚藤雜交的親和指數按以下公式計算。

式中：N，花數；N0，無花粉粒萌發的花數；N1，萌發花粉管模糊的花數；N2，萌發花粉管數少（1-3條）的花數；N3，萌發花粉管數中但花粉管不正常的花數；N4，萌發花粉管數中（4～7條）的花數；N5，萌發花粉管數多但花粉管不正常的花數；N6，萌發花粉管數多（8～10條）的花數；N7，萌發花粉管數極多（＞11條）的花數；N8，萌發花粉管伸入花柱的花數

根據親和指數確定各甘薯品種與近緣野生種厚藤雜交的親和性強弱：極弱，親和指數≤20.0）；弱，20.0＜親和指數≤40.0）；中，40.0＜親和指數≤60.0）；強，60.0＜親和指數≤90.0）；極強，親和指數＞90.0。

2 結果與分析

2.1 品種差異

將14個甘薯品種與近緣野生種進行授粉雜交，結果顯示，有6個親本品種可觀察到花粉萌發，具有一定的親和性，占總數42.9%；另有8個親本品種未觀察到花粉萌發，即表現為不親和性，占總數57.1%。因此，甘薯品種與海邊近緣野生種厚藤（Ipomoea pescaprae）雜交，有些品種具有親和的表現，但多數品種表現不親和。甘薯與近緣野生種（厚藤）雜交的正交6個組合全部表現為親和；反交中，有3個組合不親和，3個組合有少量的萌發，表現出極弱的親和性，即甘薯與近緣野生種雜交，正交親和的多，反交親和的少，表明近緣野生種作父本，容易親和；而甘薯作父本，親和性比較低。近緣野生種無明顯的甘薯雜交群別屬性，同一甘薯群別中，既有親和，也有不親和，因此，不屬于甘薯當中的雜交群別［11］（表1），親和性只跟甘薯品種有關。

表1 甘薯和海邊近緣野生種雜交親和情況

2.2 花粉粒萌發類型

不同的品種組合，萌發的花粉管有差異，表明與近緣野生種厚藤雜交親和的甘薯品種，親和性有一定的差異?；ǚ勖劝l的差異，可分為5種類型。無花粉萌發：由圖1可知，普薯32與海邊近緣野生種雜交，只見花粉粒（箭頭所指），無萌發的花粉管，說明雜交不親和?；ǚ酃苣：夯ǚ哿Ｃ劝l的花粉管似是而非（圖2），模棱兩可（箭頭所指）?；ǚ酃芗氶L：廣薯87與海邊近緣野生種雜交，花粉粒萌發的花粉管細長（圖3），無膨大的花粉管頭，不正常（箭頭所指）?；ǚ酃苷＃汉＿吔壱吧N與廣薯79雜交，花粉粒萌發的花粉管略粗，花粉管頭膨大（圖4），花粉管多且正常（箭頭所示），親和性好。花粉管進入花柱：海邊近緣野生種與廣薯79雜交（圖5），花粉管進入花柱（箭頭所示）。

圖1 普薯32×海邊近緣野生種

圖2 花粉管模棱兩可

圖4 海邊近緣野生種×廣薯79（一）

圖5 海邊近緣野生種×廣薯79（二）

2.3 親和指數及差異

根據萌發的花粉管不同，計算親和指數，親和強弱。結果表明，廣薯79×海邊近級野生種組合親和指數最高，為50.7，能達中等親和；5個組合弱，3個組合極弱，沒有強或極強組合（表2）；說明目前的測試中，與海邊近緣野生種（厚藤）雜交，并未發現親和性較好的甘薯品種。

表2 親和雜交組合親和指數計算和親和性評價

2.4 不同時期親和性差異

親和組合中，不同時期親和性強弱亦有差異。從圖6可知，親和指數出現明顯峰值。親和性較典型的品種廣薯87、廣薯79及廣紫薯2號親和指數出現雙高峰值趨勢，分別出現在11月上旬、11月中旬和次年4月的下旬，但不同的親和組合或有一定的差異，有的偏強，有的偏弱；在最適合的親和期雜交，容易結實，可收到雜交種子。因此，在親和指數較低的情況下，需選擇親和指數高峰期進行雜交，才更有望達到結實效果。

圖6 雜交親和指數曲線圖

2.5 雜交掛果

在與海邊近緣野生種（厚藤）的雜交組合中，作母本的廣薯87、廣紫薯2號，和廣薯79的親和指數相對較高，分別為39.0、44.8和50.7；雜交授粉（2020年3月27日）后，第一次（4月7日，即10日后）調查顯示，掉果率分別是77.8%、41.7%和10.0%。由此可見，親和指數越低，越容易掉果，且掉果率高；親和指數相對高的品種，掉果率也低，掛果率高，差異趨勢明顯；說明測定親和指數，對實際雜交有一定的指導作用，可避免無效雜交。第二次（4月10日，即13日后）調查顯示，弱親和性組合已全部掉果，而中度親和性組合還有40.0%的掛果率，表明親和性弱易掉果，親和性強則可延長掛果期（表3）。

表3 親和指數高組合掛果測試

3 討論與結論

3.1 討論

研究表明，廣州甘薯開花制種季節（10—12月），甘薯與海邊近緣野生種雜交，多數品種無花粉萌發，表現為不親和，可能是由于胼胝質［12］隨著溫度下降而增多所至；隨著次年春季高溫來臨，漸見花粉萌發，此時較適宜授粉雜交，可見結實，但此時正值高溫高濕期，親本苗老化，不利于進一步結實觀察試驗。據報道，不同甘薯栽培種與四倍體近緣野生種海濱野牽牛（I.littoralis）雜交后的結實率有明顯差異。雜交結實率比較高的組合，其親本栽培歷史長，遺傳基礎穩定；而結實率較低或根本不結實的組合，多半為播種1—2年的雜種后代品系，遺傳基礎特別是減數分裂行為不穩定，有可能影響其與四倍體野生種雜交的結實率［13］，這與本研究的雜交親和結果相似。同時，從形態特征看，試驗用的海邊近緣野生種（厚藤）與甘薯親緣關系較遠，授粉雜交測試過程有很多品種無花粉萌發；而萌發的組合，正反交差異也很大，且花粉萌發效果不穩定。測定親和性，從中篩選高親和指數的強親和組合，在適宜的親和期進行雜交授粉，雜交組合可結實，同時可收獲種子。在強親和組合中，可進一步將甘薯與野生種雜交的胚珠進行離體培養，提高種間雜交成苗的成功率，解決甘薯與近緣野生種雜交后胚發育中止的問題［14］，有望培育出甘薯與海邊近緣野生種厚藤的雜交苗，充分利用海邊近緣野生種厚藤的耐鹽基因、藥效及其抗逆性強的優勢。

3.2 結論

本研究測定了甘薯與海邊耐鹽近緣野生種（厚藤）的雜交親和性，結果顯示，可觀察到花粉萌發，但親和性強弱與品種、開花時期有關。因此，測定親和性，并估算親和指數，篩選強親和組合，對指導厚藤和甘薯品種配組雜交具有一定意義，也便于收獲雜交種子，避免無效雜交。