凝血酶原時間衍生法與馮·克勞斯法測定纖維蛋白原結果的一致性及臨床應用*

張艷，楊怡，金心（國藥葛洲壩中心醫院＆三峽大學第三臨床醫學院檢驗科，湖北宜昌 443002）

纖維蛋白原（fibrinogen，Fib）是一種由肝細胞合成［1］的具有凝血功能的蛋白質，是纖維蛋白的前體。Fib具有雙重生物活性，既是凝血酶作用的底物，又是高濃度纖溶酶的靶物質，其主要生理功能是進入血液循環后參與凝血和調節纖溶［2］，與應激反應、動脈血栓形成、彌漫性血管內凝血等密切相關［3］。目前，Fib 的檢測方法主要有馮·克勞斯（Von Clauss）法及凝血酶原時間衍生法（prothrombin time-derived，PT-der法）2 種［4］。Von Clauss法是WHO推薦的參考方法［5］，也是美國國家臨床檢驗標準委員會推薦的Fib 常規測定方法［6］。Fib 因基因多態性［7］而具有高度異質性，其檢測受較多因素影響。文獻報道［8］在沒有異常Fib 存在的情況下，PT-der法檢測結果在2.00～4.00 g／L 時可替代Von Clauss 法。但在驗證過程中發現，幾乎所有PT-der 法檢測Fib 的結果均比Von Clauss 法高10%～20%。在查閱資料后推測，2 種方法檢測結果誤差的原因可能是使用了同一校準品但賦值不同。本研究擬用量值傳遞的方法校準PT-der法，即以可溯源的Von Clauss 法賦值混合血漿對PT-der法進行重新定標，再用大量臨床樣本確立其與Von Clauss法檢測結果的一致性區間和適用范圍。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 沃芬TOP 700和TOP 300 全自動凝血分析儀及其配套試劑（Von Clauss法試劑批號N0688281，PT-der法試劑批號N0386789）、校準品（批號E0177755）和雙水平質控品（批號N0386250和H0864436）。校準品中Fib 可溯源至英國國家生物制品檢定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）。

1.2 樣本

1.2.1 標本來源 國藥葛洲壩中心醫院2018年11月至2019年4月住院及門診檢測凝血項目的患者5 142例，年齡2～95 歲（中位年齡52 歲），其中男2 619例，女2 523例。采集清晨空腹靜脈血1.8 mL于真空凝血采血管（含0.2 mL 0.109 mmol／L 枸櫞酸鈉抗凝劑）中，以離心力2 000×g離心15 min，剔除黃疸、溶血、脂血標本及重度貧血患者標本。

1.2.2 混合血漿制備 用30 份新鮮血漿按低值、正常和高值以4 ∶23 ∶3 的比例等量混合（基于本院近2年約50 000份臨床樣本結果分布所得）。

1.3 PT-der法校準

1.3.1 混合血漿賦值 用Von Clauss 法連續檢測混合血漿Fib 20次，計算其剔除離群值（超3 倍標準差）后的均值，以此均值作為該混合血漿的賦值。

1.3.2 校準 用已賦值的混合血漿作為校準品依照原廠校準方法（六點擬合直線）校準PT-der法。

1.4 性能驗證

1.4.1 精密度驗證 參照美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A文件［9］推薦方法進行。選擇正常和異常2個濃度水平的質控品，用PT-der法測定Fib。先將各濃度水平取1支復溶，再分裝成5 份，冷藏，每天取出各1份復溫后在1批中檢測，每批每個水平重復測定3次，每個項目連續測定5 d，將所測定結果進行統計學分析，計算批內精密度、批間精密度、實驗室內標準差（s1）、自由度（T）和驗證值（V）。當s1＜V時認為廠家聲明的精密度通過驗證。

1.4.2 線性范圍驗證 參照CLSI EP6-A文件［10］，選擇低值（L）和高值（H）樣品各1 份，將低值和高值樣本按4 ∶0、3 ∶1、2 ∶2、1 ∶3、0 ∶4 的比例混合，得到5份線性試驗樣本。對上述樣本重復測定3 次，取平均值。各樣本濃度的預期值按公式（CL×VL＋CH×VL）／（VL＋VH）計算（式中C 為樣本濃度，V 為樣本體積）。將實測平均值與預期值先進行數據檢查，剔除離群值，再用多元線性回歸分析，并繪制散點圖進行評價。

1.4.3 重新制定本區域人群的參考區間 參照WS／T 402—2012《臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定》［11］，選取不低于120 例表觀健康體檢者（排除妊娠、糖尿病、血栓類疾病、腎病、免疫系統疾病、血液病、肝臟疾病），采集空腹抗凝血用Von Clauss法和PT-der法檢測Fib，分別取總體結果的95%置信區間（P2.5～P97.5）為本區域人群參考區間。

1.5 樣本檢測 在室內質控檢測結果在控的情況下，在TOP700 和TOP300 上同時用Von Clauss 法及PT-der法檢測血漿樣本Fib，采集樣本2 h 內完成檢測。各項操作嚴格按照儀器、試劑說明書及操作規程進行。將PT-der 法檢測結果設為觀察組，Von Clauss法檢測結果設為參照組。

1.6 確立一致性區間及適用范圍 用2018 年11月至2019年4月本院凝血樣本分別用PT-der法與Von Clauss法檢測Fib。以Von Clauss法檢測為參照，確立PT-der法與Von Clauss法99%的結果符合WS／T 406—2012《臨床血液學檢驗常規項目分析質量要求》［12］中Fib 準確度要求（偏倚≤20%）范圍內的數值區間和適用范圍。偏倚以Von Clauss法檢測結果為比對標準；符合率為同一樣本用以Von Clauss法結果為靶值，PT-der 法檢測結果達到準確度要求（偏倚≤20%）的比例。

1.7 統計學分析 采用Excel 2010 軟件進行。計算ˉx、s、偏倚等，計量資料以表示，進行線性回歸分析，擬合線性方程并計算相關系數（r）。

2 結果

2.1 校準前PT-der法與Von Clauss法Fib 檢測結果一致性分析 在用原廠校準模式時，對PT-der法線性范圍（0.70～7.00 g／L）內的855 例樣本結果進行了比對，總計70.18%（600／855）的PT-der 法檢測結果符合WS／T 406—2012的準確度要求，見表1。

表1 重新校準前兩種Fib檢測結果的比較

2.2 校準后PT-der法的性能驗證

2.2.1 精密度驗證結果s1（分別為0.081 和0.068）在正常和異常商業質量控制參考水平下均小于V（分別為0.101和0.085），表明廠家聲明的精密度通過驗證。

2.2.2 線性范圍驗證結果 PT-der 法檢測Fib 的預期值（y）與實測值（x）無明顯離群值，最佳擬合方程為二次多項式，回歸方程為y＝－0.006 2x2＋0.949 4x＋0.036 7，r2＝0.999 9，5個濃度梯度標本的偏差為－0.58%～0.62%，平均偏差為－0.07%。以WS／T 406—2012 的偏倚（≤10%）為評判標準，PT-der法檢測Fib在0.70～7.01 g／L 范圍內呈臨床可接受的三階線性，廠家聲明的0.70～7.00 g／L 線性范圍通過驗證。

2.2.3 本區域人群的參考區間 127 例符合入選標準的體檢者，年齡23～73 歲（中位數為42 歲），其中男72 例，女55 例。用PT-der 法檢測Fib 結果為2.18～5.11 g／L（95%置信區間為2.29～5.02 g／L），用Von Clauss法檢測結果為2.25～5.07 g／L（95%置信區間為2.33～4.95 g／L），均無離群值。本實驗室PT-der法、Von Clauss法檢測Fib 的參考區間分別為2.29～5.02 g／L、2.33～4.95 g／L。

2.3 校準后的PT-der法與Von Clauss法Fib 檢測結果的一致性分析

2.3.1 樣本分布 2018 年11 月至2019 年4 月用2 種方法檢測Fib總計5 142例，其中Von Clauss法檢測結果異常1 199例，低于參考區間723例，高于參考區間476例。

2.3.2 適用條件 結果比對時發現，一些特殊情況（總計44份，占總樣本的0.86%）的檢測結果偏差較大，包括：（1）大量使用抗凝藥物后（如透析后）；（2）明確診斷肝硬化失代償期等影響凝血的疾病；（3）纖維蛋白降解產物（FDP）≥30 mg／L；（4）凝血酶時間（TT）≥25 s時；（5）活化部分凝血活酶時間（APTT）≥80 s。

2.3.3 PT-der法適用范圍的確定 排除上述異常樣本后，總計有5 098 份，年齡區間為2～93 歲，其中男2 596例，女2 502 例，PT-der法結果在1.51～7.00 g／L區間內時4 995份樣品中4 981 份符合一致性要求（相對偏差≤20%），符合率為99.72%，見表2。

表2 重新校準后2種Fib檢測結果的比較

2.4 實際應用 結合以上研究和驗證結果設立本實驗室Fib 的檢測方案：2 臺TOP Family 系列凝血儀先分別用本研究方法進行PT-der法校準，再用2種方法同時檢測20 例以上樣品，如PT-der 法95%及以上樣品結果與Von Clauss 法結果的偏倚≤20%，則認為校準成功，反之重新校準。校準成功后日常所有Fib 的樣本均使用PT-der 法進行初次檢測，（1）如結果在1.51～7.00 g／L 范圍內且未出現2.3.2中不適用條件時，直接報告結果；（2）如出現2.3.2中不適用條件，手動使用Von Clauss 法復測Fib；（3）如結果不在1.51～7.00 g／L范圍內則會自動使用（已設置好的復檢程序）Von Clauss 法復測Fib；（4）使用自建PT-der 法參考區間進行臨床報告。在確立本方案后，本實驗室半年中Fib 復測率僅為3.89%（418／10 975），如使用相關文獻［8］報道方案估算復測率為35.65%（3 913／10 975），大幅度的提高了檢測速度（PT、APTT、TT 和Fib 在TOP700聯合檢測可由原先的每小時60 例提升至每小時78例）和效率并減少了試劑開支。

3 討論

Fib是凝血狀態的重要標志物［13］，近年來研究發現其水平過高易引起缺血性心臟病、心源性猝死等心血管疾病［14］，其水平過低也會導致凝血過程中血凝塊形成質量下降［15］，從而易引起出血性疾病。Von Clauss法目前是Fib 檢測的參考方法［5］；而PT-der法可在儀器測定凝血酶原時間（prothrombin time）時，通過Fib形成的纖維蛋白，根據纖維蛋白濁度推算出Fib的含量［16］，更為經濟實用。有文獻報道［4，17］PT-der 法和Von Clauss 法在正常范圍內的檢測結果較為接近，而在異常范圍內則相差較大，也有學者認為PT-der 法不是一種可靠的方法［5，17-18］。

本實驗室驗證2種方法檢測2.00～4.00 g／L濃度Fib的一致性時發現，PT-der 法檢測Fib 的結果幾乎均高于Von Clauss法10%～20%。查閱說明書后發現，上述2種方法使用同一校準品但賦值卻不相同，所以推測賦值不同引起檢測結果不同。一項多中心研究指出PT-der 和Von Clauss方法之間的偏差取決于校準曲線，且差異程度與校準曲線和血漿樣品濁度有關［19］。而制造商提供的校準品濁度較高，考慮到這兩方面因素，我們采用量值傳遞方式給新鮮清澈的混合血漿賦值，并以此重新校準PT-der法［16］。所謂量值傳遞就是將國際（國家）計量基準所復現的量值，通過檢定或校準方式傳遞給下一級計量標準，并依次傳遞到工作計量器具，以保證量值準確一致［20］。本研究正是使用參考方法校準常規（下一級）方法，完全依照量值傳遞方式進行。因為Von Clauss法具有完整溯源鏈，所以重新校準的PT-der 法也可以沿著Von Clauss法溯源鏈一級一級追溯到NIBSC（原廠的溯源計量標準）。

關于2種方法結果相關性的研究較多，但大多數只停留于結果比對階段，分析PT-der 法的結果是否準確，但不同品牌、不同型號的血凝儀2 種方法的差異程度也不盡相同［4］。而本研究卻通過量值傳遞的方法重新校準并驗證了PT-der 法，并使用大量樣本的結果比對建立了PT-der 法的適用條件和范圍，使2種方法檢測結果在一定范圍內可以互換。與此同時Rizzo等［21］也發現，不同方法檢測到的Fib水平的偏差與肝硬化的嚴重程度有關，與本研究結果一致，即在肝硬化失代償期，2 種方法的檢測值偏差可能超過20%。

值得注意的一點是，2 種方法原廠給出的參考區間并不完全相同，但所查閱到的文獻均未提及。因此，本研究對PT-der 法進行了重新校準，重新建立了本實驗室的參考區間。在研究中，我們發現2種方法的一致性區間涵蓋了2種方法的參考區間，而PT-der法參考區間又涵蓋了Von Clauss法參考區間，加之實際應用中幾乎所有一致性區間內的結果均使用PT-der 法檢測，故可用PT-der 法參考區間進行臨床報告。

需要指出，本研究僅使用本區域人群的檢測數據，基于本實驗室的設備和試劑并制定檢測方案，不具有普遍適用性。不同實驗室可借鑒此方法制定出適宜自己實驗室的檢測方案，在保證檢驗質量前提下以最小的成本和最快的速度為臨床和廣大患者服務。